Långsiktig Högupplösta Intravital Mikroskopi i lungan med en vakuum Stabiliserad Imaging Fönster
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Metastas till sekundära platser såsom lunga, lever och ben är en traumatisk händelse med en dödlighet på cirka 90% 1. Av dessa platser, är den svåraste att bedöma med hjälp av intravital optisk avbildning lungan på grund av dess slutna läge i kroppen, delikat natur och viktig roll för att upprätthålla korrekt fysiologi. Medan kliniska modaliteter (positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRT) och datortomografi (CT)) kan tillhandahålla icke-invasiva bilder av denna vävnad, de saknar upplösning som krävs för att visualisera de tidigaste sådd händelser, med en enda pixel bestående av nästan tusen celler. Nuvarande modeller av metastaserad lung sådd postulat att händelser strax efter en tumörcell ankomst är deterministiska för överlevnad och efterföljande tillväxt. Detta innebär att i realtid intravital bildframställning med en enda cell upplösning 2 krävs för att definiera fenotyper av sådd cells och testa dessa modeller. Medan hög upplösning optisk avbildning av lungan har utförts med användning av olika ex vivo preparat, dessa experiment är typiskt enda tidspunktsanalyser och är känsliga för artefakter och eventuella felaktiga slutsatser på grund av den drastiskt förändrad miljö (temperatur, profusion, cytokiner, etc. ) till följd av avlägsnande från brösthålan och cirkulationssystemet 3. Senaste arbete har visat att tidsförlopp intravital optisk avbildning av den intakta lungan är möjlig med hjälp av en vakuum stabiliserad avbildning fönster 2,4,5 har dock typiska avbildnings gånger varit begränsade till cirka 6 timmar. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra långsiktiga intravital tidsförlopp avbildning av lungan med användning av ett sådant fönster under en period av 12 h. Time-lapse bildsekvenser erhålls med denna metod möjliggör visualisering och kvantifiering av cell-cell interaktioner, membrandynamik och vaskulär perfusion i lungan. Vi ytterligare dEscribe en bildbehandlingsteknik som ger en exempellöst tydlig bild av lungan mikrovaskulaturen.
Introduction
Högupplöst intravital optisk avbildning har visat sig vara avgörande för att förstå många biologiska processer, vilket gör encelliga och sub-cellulära parametrar som skall mätas och kvantifieras. I cancerforskningen har intravital avbildning av tumör och stromaceller ledde till upptäckten av många microenvironmental interaktioner 6-11 som endast förekommer i det intakta djuret.
Upptäckter om mikromiljöer i samband med intravasering och spridning av tumörceller i bröstcancer med hjälp av en enda cell upplösning optisk avbildning in vivo har även lett till nya markörer för prognos och svar på behandling i bröstcancerpatienter 12-16. De bästa avbildningstekniker tillgängliga för visning djupt inom intakta inre vitala organ är de kliniska modaliteter (MRI, PET, CT) som erbjuder utmärkt utsikt över hela organet och kan avslöja sjukdomar innan de producerar kliniska symtom. De är inte, however, för att avslöja de tidigaste stadierna av metastaser och de cellulära mekanismer som driver tumörprogression på grund av deras brist på en enda cell upplösning. Vid tiden lungmetastaser är synliga i dessa villkor, de är väl etablerade och breder ut sig. Med tanke på uppskattningen att 90% av spridda tumörceller som anländer till lungan antingen inte överlever 17 eller initialt förblir vilande 18, och observationen att de anländer mycket tidigare än väntat 19, avbildning de tidigaste stegen ankomst och överlevnad blir avgörande för förstå processen av metastaserad sådd och återfall av tumörtillväxt på avlägsna platser.
Utföra dessa observationer i lungorna har visat sig vara extremt svårt men; den stora majoriteten av imaging studier har utnyttjat ex vivo eller Explantation förberedelser 20-23, som bara ger en inblick i lungan vid enstaka tidpunkter. Även om dessa preparat gör ge användbar informationrmation, ger de inte en fullständig förståelse av samspelet, orsak och verkan, och dynamik som uppstår mellan de olika komponenterna i den mikromiljö. Avsaknaden av en riktig cirkulationssystemet (och samtidig obalans av homeostas) och frånkoppling från resten av kroppens immunsystem gör det önskvärt att validera de slutsatser som dessa preparat genererar i intakt vävnad in vivo.
Många grupper har utfört intravital avbildning av den intakta lungan 2,4,5,24-33 med Wearn och tyska är den första att kirurgiskt exponera pleura skiktet 24 och Terry först med att utnyttja en implanterbar avbildningsfönster 25.
Högupplösande avbildning i lungan är kraftigt hindras av lungans konstant rörelse och flera tekniker har utvecklats för att övervinna denna begränsning. Wagner och Filley 27 studerade naturlig rörelse hundlungaoch utformat sina kirurgiska protokoll för att lokalisera deras implanterade fönster över en relativt stillastående region medan Wagner utnyttjade vakuum i sitt fönster kirurgisk förberedelse för att immobilisera vävnaden 28. Sedan dess har en mängd olika tekniker använts för att bilden lungan inklusive: luftrör kläm, sekventiell apné och gated imaging, översamplade förvärv, limning av lungan lob och vakuum 34. Var och en av dessa har sina fördelar och nackdelar och ingen teknik har vuxit fram som överlägsen till en annan 34. Exempelvis bronk fastspänning och sekventiell apné förändra den normala gasutbyte i lungan och kan orsaka atelektas. Gated imaging och samplade förvärvet inte lider av dessa nackdelar, men kräver hög hastighet eller specialiserad bildutrustning inte allmänt tillgängliga. Slutligen både limning av lungan och vakuumteknik undvika båda av de ovan nämnda nackdelarna, men kan uppvisa skjuvkraft inducerad skada om vård är inte taksv. Under de senaste åren har vakuumfönstret har miniatyriserade och anpassade för användning i möss med användning av konfokal och multifotonmikroskop 4,5,33 och utmärkt hög upplösning avbildning har uppnåtts två. Tabell 1 sammanfattar denna rika historia och belyser de papper som beskriver nya framsteg i användningen av intravital lungavbildningsfönster.
Detta protokoll beskriver användningen av förlängda tidsförlopp multifoton intravital mikroskopi för att bilden metastaser i lever, intakt lunga med högsta subcellulära möjliga upplösning. Bilderna förvärvas för upp till 12 timmar med hjälp av en multifotonmikroskop utrustad med en hög numerisk öppning objektiv och flera fotomultiplikatorrör (PMT) detektorer. Transgena musmodeller används för att fluorescerande etikett infödda makrofager tillsammans med fluorescerande hög molekylvikt dextran och fluorescerande protein transfekterade tumörceller (för att märka kärlsystemet och tumörceller respectively). Även om detta val av fluorescerande celler möjliggör visualisering av tumörcell endotel cell makrofag växelverkan och dynamik, kommer detta protokoll fungerar för alla stam av fluorescerande eller icke-fluorescerande mus. Efter förvärvet återstående drift rörelse (om någon) elimineras med hjälp av en Fiji plugin 35,36 och anpassade makron medelvärdet kärlkanalen för att eliminera blinkande orsakas av omärkta cirkulerande blodkroppar.
Även om detta protokoll fokuserar på avbildning metastasering, teknikerna är tillämpliga på många andra biologiska processer observer med hög upplösning encelliga avbildning i lungan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hög upplösning in vivo optisk avbildning i kombination med fluorescerande funktionella taggar såsom proteiner och antikroppar har dramatiskt ökat vår förståelse av metastaserande kaskad. Det har möjliggjort direkt visualisering och kvantifiering av encelliga och sub-cellulära parametrar i tumörceller, värdceller och deras mikromiljö. Denna avbildning inom den primära tumören har lett till exempel, till upptäckten av diskreta mikromiljöer som stöder antingen tillväxt invasion eller spridning <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W., Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
- Wagner, W. W. Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Hauser, H., Wagner, R. . Mammalian cell biotechnology in protein production. , (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
