Долгосрочный высокого разрешения Прижизненные микроскопии в легких с помощью вакуумного стабилизированный визуализации окна
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
Метастазы вторичных сайтов , таких как легкие, печень и кости является травмирующим событием со смертностью около 90% 1. Из этих сайтов, легких является наиболее трудно оценить с помощью прижизненной оптических изображений из-за его закрытого положения внутри тела, деликатности и жизненно важную роль в поддержании надлежащей физиологии. В то время как клинические методы (позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и компьютерная томография (КТ)) способны обеспечить неинвазивные изображения этой ткани, у них нет разрешения, необходимые для визуализации самые ранние посевные события, с одного пикселя состоящий из почти тысячи клеток. Современные модели метастатического легких высева постулата, что события только после прибытия опухолевой клетки являются детерминированными для выживания и последующего роста. Это означает , что в режиме реального времени инструменты прижизненной визуализации с одной разрешением ячейки 2 необходимы для того , чтобы определить фенотипы высевающего CELLs и тестировать эти модели. В то время как высокая разрешающая способность оптических изображений легких было проведено с использованием различных препаратов исключая виво, эти эксперименты , как правило , одиночный отсчете анализы и восприимчивы к артефактам и возможных ошибочных выводов из – за резко изменял окружающей среды (температура, обильность, цитокины и т.д. ) в результате удаления из полости грудной клетки и сердечно – сосудистой системы 3. Недавние исследования показали , что в заданный промежуток времени прижизненной оптических изображений интактного легкого можно с помощью вакуума стабилизирован окна визуализации 2,4,5 однако, типичное время обработки изображений было ограничено приблизительно 6 ч. Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного визуализации прижизненной замедленную легкого с использованием такого окна в течение 12 часов. В последовательности изображений время покадровой, полученные с помощью этого метода позволяют визуализации и количественного определения межклеточных взаимодействий, динамика мембран и сосудистой перфузии в легких. Мы также dописывать круг методику обработки изображения, которое дает беспрецедентно четкое представление о микрососудов легких.
Introduction
Высокое разрешение прижизненной оптических изображений, оказалось иметь решающее значение для понимания многих биологических процессов, что позволяет одноклеточных и субклеточные измеряемые параметры и количественно. В исследованиях рака, прижизненной визуализации опухолей и стромальных клеток привело к открытию многих микроокружения взаимодействий 6-11, которые присутствуют только в интактных животных.
Открытия о микросреды , связанных с intravasation и распространения опухолевых клеток при раке молочной железы с использованием оптических изображений одного элемента разрешения в естественных условиях даже привело к новым маркеров для прогноза и ответа на лечение у больных раком молочной железы 12-16. Лучшие технологии обработки изображений, доступных для просмотра глубоко внутри неповрежденных внутренних жизненно важных органов являются клинические методы (МРТ, ПЭТ, КТ), которые предлагают отличный вид на весь орган и может выявить патологию еще до того, они производят клинические симптомы. Они не в состоянии, чowever, чтобы выявить самые ранние стадии метастазирования и клеточные механизмы вождения прогрессии опухоли из-за их отсутствия одной резолюции клетки. К тому времени, метастазы в легких видны в этих условиях, они хорошо известны, и пролиферирующих. С учетом подсчитали , что 90% диссеминированных опухолевых клеток , которые поступают в легкие либо не выживают 17 или первоначально оставаться в состоянии покоя 18 и наблюдения , что они прибывают намного раньше , чем ожидалось ранее 19 обработки изображений самые ранние этапы прибытия и выживание становится решающим для понимание процесса метастазирования высева и рецидивов роста опухоли в отдаленных местах.
Выполнение этих наблюдений в легких оказалось чрезвычайно трудно, однако; подавляющее большинство исследований визуализации использовали препараты или исключая виво эксплантов 20-23, которые только дают представление в легких в отдельных временных точках. В то время как эти препараты действительно обеспечивают полезную информациюия, они не дают полного понимания взаимодействий, причинно-следственных связей и динамики, которые происходят между различными компонентами микросреды. Отсутствие надлежащей системы кровообращения (и сопутствующего дисбаланса гомеостаза) и отключения от остальной части иммунной системы организма делает его желая подтвердить выводы , что эти препараты производят в неповрежденной ткани в естественных условиях.
Многие группы проводили прижизненной визуализации неповрежденного легкого 2,4,5,24-33 с Wearn и немецком языках является первым хирургическим путем подвергать плевральной слой 24 и Терри первым использовать имплантируемый окно визуализации 25.
Высокое разрешение изображения в легких значительно затрудняется постоянном движении лёгкого и несколько методов, которые были разработаны, чтобы преодолеть это ограничение. Вагнер и Filley 27 изучал естественное движение собачьей легкогои разработали свой хирургический протокол , чтобы определить местонахождение их имплантированный окно над относительно стационарной области в то время как Вагнер используется вакуум в его окне хирургической подготовки к иммобилизации ткани 28. С тех пор различные методы были использованы для получения изображения легких , включая: бронха зажима, последовательного и одышки закрытого типа визуализации, передискретизация приобретение, склейки доли легкого и вакуума 34. Каждая из них имеет свои преимущества и недостатки , и ни одна техника не стала еще выше 34. Например, бронх зажимное и последовательное апное изменять нормальный обмен газов в легких и может вызвать ателектаз. Воротами изображений и передискретизация приобретение не страдают от этих недостатков, но требуют высокой скорости или специализированного оборудования визуализации не широкого доступа. В конце концов обе склеивание легкого и техника вакуума во избежание обоих указанных выше недостатков, но могут проявлять усилие сдвига индуцированное повреждение, если не будут Takэн. В последние годы, окно устанавливается вакуум миниатюризации и адаптирован для использования в мышах с помощью конфокальной микроскопии и многофотонной 4,5,33 и превосходное ни высокая разрешающая способность была достигнута 2. В таблице 1 обобщены эту богатую историю и выдвигает на первый план те бумаги , которые описывают роман достижения в области использования прижизненной окон визуализации легких.
Этот протокол описывает использование расширенного покадровой многофотонная прижизненной микроскопии для метастазирования изображения в живом, неповрежденного легкого с самым высоким разрешением субклеточном возможно. Изображения приобретены до 12 часов с использованием многофотонного микроскопа, оборудованного с высокой числовой апертурой объектива и многократный ФЭУ (ФЭУ) детекторов. Трансгенные мышиные модели используются для флуоресцентно этикетке нативных макрофагов наряду с флуоресцентным высокой молекулярной массы и декстрана флуоресцентный белок, трансфицированных опухолевых клеток (маркировать сосудистую систему и опухолевые клетки respectivelу). В то время как этот выбор флуоресцентно меченых клеток позволяет визуализировать клеток-эндотелиальных клеток-макрофагов взаимодействия опухолевых и динамики, этот протокол будет работать для любого штамма флуоресцентной или нефлуоресцентной мыши. После приобретения, движение остаточного дрейфа (если таковой имеется ) устраняется с помощью Фиджи плагин 35,36 и пользовательские макросы Среднее время сосудистого русла , чтобы устранить мигание , вызванное немеченых циркулирующих клеток крови.
В то время как этот протокол фокусируется на метастазирование визуализации, методы применимы ко многим другим биологическим процессам, наблюдаемых с высокой разрешающей способностью изображений одноклеточного в легком.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высокое разрешение в естественных условиях оптической визуализации в сочетании с флуоресцентно меченных функциональных тегов , таких как белки и антитела резко возросло наше понимание метастатического каскада. Это дало возможность прямой визуализации и количественной оценки о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
References
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
- Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
- Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
- Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
- Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124 (2012).
- Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
- Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112 (2014).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
- Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
- St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562 (2009).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
- Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
- De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
- Wagner, W. W., Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
- Wagner, W. W. Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
- Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
- Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
- Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Hauser, H., Wagner, R. . Mammalian cell biotechnology in protein production. , (1997).
- Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
- Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).
