Summary
Följande artikel ger en enkel, reproducerbar teknik för att effektivt skapa en modell för hållbar mus av limbus stamceller brist (LSCD). Denna djurmodell är användbar vid testning och jämföra effekten av behandlingar för limbus stamcellssjukdomar.
Abstract
Limbus stamceller brist (LSCD) är ett tillstånd av fel eller förlust av limbus epitelceller stamceller, varefter hornhinnans epitel ersätts med bindhinna. Patienter lider av återkommande kornealdefekter, smärta, inflammation och förlust av synen.
Tidigare var en murin modell av LSCD beskrivits och jämfördes med två andra modeller. Målet var att ta fram en konsekvent musmodell av LSCD att båda härmar fenotyp hos människor och varar tillräckligt länge för att göra det möjligt att studera sjukdomen patofysiologi och att utvärdera nya behandlingar. Här, är den teknik som beskrivs mer i detalj.
En motordriven verktyg med en roterande Burr har utformats för att avlägsna de rostringarna från hornhinnans yta eller att jämna ut pterygium sängen i patienter. Det är en lämplig anordning för att skapa den önskade LSCD modellen. Det är ett lätt tillgängligt, lätt att använda verktyg med en fin spets som gör det lämpligt för att arbeta med små ögon, somi möss. Dess tillämpning förhindrar onödigt trauma för ögat och det inte leder till oönskade skador, som ofta är fallet med kemiska skademodeller. I motsats till en trubbig skrapa, det tar bort epitelet med basalmembranet. I detta protokoll, var limbal området slipas två gånger, och sedan hela hornhinnans epitel rakades från limbus till limbus. För att undvika stroma skada, såg man inte att borsta hornhinnans yta när epitel har redan tagits bort.
Introduction
Hornhinneepitelet krävs för att bibehålla den klarhet och integritet av hornhinnan. Det är hela tiden förnyas under hela livet av epitelstamceller bosatta i limbus-en smal zon vid korsningen av hornhinnan och bindhinnan. Dessa självförnyande limbus stamceller spelar en avgörande roll i regenerering av hornhinnans epitel, både normalt och efter skada. Partiell eller fullständig uttömning av dessa stamceller kommer att resultera i återkommande korneala erosioner, smärta, ärr på hornhinnan och kärlnybildning, utseende av bägarceller, och om de lämnas obehandlade, hornhinnan blindhet. Detta tillstånd kallas limbus stamceller brist (LSCD) och kan vara idiopatisk; ärftlig; eller förvärvas på grund av kemiska eller termiska skador, långsiktiga kontaktlinser, och kronisk inflammation 1-6.
Forskning om LSCD kräver en lämplig djurmodell som inte bara efterliknar sjukdom hos människor, men är reproducerbar och hållbar, med minst enfäste för skador på andra hornhinnan och ögonstrukturer. Denna modell är nödvändigt att bedöma behandlingar och klargöra sjukdomsmekanismer vid molekylära och cellulära nivåer. Som beskrivits tidigare en, med hjälp av en roterande Burr, kan man lätt ta fram en musmodell av LSCD som har de ovannämnda fördelarna och kvarstår i minst tre månader. Målet med denna studie är att presentera en enkel, reproducerbar och hållbar musmodell av LSCD.
Den roterande burr är ett praktiskt verktyg som jämnt bort epitel utan att skada den underliggande stroma en. Det har använts för att inducera centralt korneal erosion 7, 8 vid sårläkning studier. Den härvid-presenterad teknik för att skapa LSCD i en mus har inte rapporterats tidigare. Tidigare infört metoder för att skrapa epitelet med en trubbig spatel resulterar i en mindre enhetlig skadefri speciellt vid limbus-och en mer varierande fenotyp 1, 9, med mer restaurering of normal hornhinneepitelet 1. Till skillnad från den trubbiga skrapan, den roterande Burr avlägsnar det epiteliska basalmembranet samt 7, 8, 10. Andra rapporterade metoder för att avskilja stamceller involvera användningen av kemikalier, såsom natriumhydroxid, n-heptanol, och bensalkoniumklorid, som inte bara kan inducera oönskad skada på underliggande ögonstrukturer, men också kan leda till signifikant inflammation och efterföljande korneal opacifikation eller epitelial skivepitelmetaplasi 11-15. Den roterande Burr är inte associerat med dessa allvarliga komplikationer. Kirurgiskt avlägsna limbal epitel, ensam eller med användning av kemikalier 10, 11, 16, är svårare att utföra och är inte det bästa alternativet i djur med små ögon och en tunn limbus epitel (som möss). Dessutom, överraskande, limbectomy kan fortfarande lämna en del av den limbal epitel bakom 10.
Den nedan beskrivna tekniken kommer att resultera i LSCD med neovaskularisering end conjunctivalization som efterliknar presentationen av fullständig LSCD hos patienter och varar i minst tre månader 1. Den är lämplig för dem som syftar till att studera LSCD eller sårläkning patofysiologi, immunologi och potentiella behandlingar hos möss. Möjligen, med vissa ändringar, detta förfarande kan utföras på råttor eller kaniner 10. Som den roterande Burr effektivt bort epitel, kan det användas i någon forskning som hänför sig till korneaepitelet nötning / sårskada och i alla tillhörande behandling eller molekylärbiologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som utförs på djur överensstämmer med Föreningen för forskning i Vision och Oftalmologi uttalanden för djur i Vision Research. Fjorton fyra till sex månader gamla manliga / kvinnliga C57BL / 6J möss av vildtyp användes: tio möss för skademodellen och fyra som kontrolldjur (oskadad hornhinnor).
1. Animaliska Beredning
- Söva en mus med en intraperitoneal injektion av en 100 mg / kg ketamin och 5 mg / kg xylazin-blandning. Efter bedövningen har trätt i kraft, nypa tån för att bekräfta anestesi djup; djuret bör inte reagera.
- Inspektera ögat under en spaltlampa innan de utför experimenten för att påvisa frånvaron av någon tidigare hornhinneskada.
- Ingjuta en droppe av en% tetrakain-hydroklorid på ögat. Efter 60-90 sekunder, testa hornhinnans reflex för att bekräfta frånvaron av känslan. Proparakain hydroklorid 0,5% kan användas i stället.
- När förlusten av hornhinnan känsla ärsäker, försiktigt placera en droppe av 5% povidon-jod på ögat och på håret runt ögat. Torka av droppen efter en minut eller sprida det på håret runt ögat för att förhindra håret från att störa verktygsspetsen.
2. Slip hornhinneepitelet
- Bär kirurgiska handskar och en klänning. Förbereda de nödvändiga verktyg: en steril roterande Burr och ett par av sterila pincett. För bättre kontroll, använder böjda pincett. Placera verktygen på en steril ark under förfarandet.
- Med hjälp av böjda pincett, stabilisera ögat genom att ta tag locken från den nasala sidan och försiktigt proptosing ögat. Undvik att använda för mycket tryck.
- Under ett kirurgiskt mikroskop, raka 360 ° runt limbal området två gånger med hjälp av sterila roterande Burr. Gå runt limbus med en hastighet av 5-6 sek per runda.
OBS! Burr har ett fast varvtal. Men för att det ska rotera med etablerade hastighet, "slutet muttern" bör helt åtdragna. - Ta bort hela hornhinnans epitel från limbus till limbus med roterande Burr. För bättre resultat, flytta verktyget i en cirkulär mode och håll den något parallellt med hornhinnans yta att arbeta med den laterala sidan av sin spets. Se till att inte skada de celler genom att inte åter borsta områden där epitel har redan tagits bort. Applicera inte något tryck på ögat. Rengör penselspetsen efter behov.
- Ingjuta en droppe av steril fosfatbuffrad saltlösning på hornhinnan och torka bort eventuella fristående epiteliala skikt med en mjuk rengöringsvävnad.
- Raka återstående epitel, om något.
- Var uppmärksam på musen svansen under operationen.
OBS: Om någon rörelse sker, har anestesidjupet bleka och ytterligare injektion behövs. En tredjedel till två tredjedelar av den primära injicerade volymen bör vara tillräcklig. Överdosera inte djuret med bedövnings medicinering. - Sterilisera alla verktyg innan du använder dem på en annan ögat.
3. Bekräfta Komplett Epithelial borttagning
- Applicera en droppe av 1 mg / ml fluorescein sodium på hornhinnan. Rengör hornhinnan efter 30 sekunder och undersöka det under ett mikroskop med en koboltblå filter för att kontrollera fullständigt avlägsnande av epitel.
OBS: Korneal områden med epiteliala defekter visualiseras i grönt.
4. Post-operation Care
- Placera djur på en värmefilt och förvara den på ett säkert ställe (t.ex. i sin bur) stunder under återhämtning. Inte hålla ett medvetslöst djur i sällskap med medvetna sådana.
- Applicera 1% erytromycin oftalmisk salva. Detta kommer också att förhindra torra ögon. Fortsätt ansökan antibiotika dagligen i en vecka.
- Injicera 0,1 mg / kg buprenorfin subkutant efter ingreppet och igen efter 12 timmar. Fortsätta injektionen två gånger per dag i två dagar.
- Observera djuret för 30 - 45 minuter, tills fullständig återhämtning från anestesi.
NOTERA: Mild rörelse av andningsmuskulaturen på den ventrala ytan indikerar djur wellness stunder under återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inom en månad efter att ha utfört den här tekniken, som utvecklats 100% av hornhinnorna ytliga kärlnybildning (Figur 1A. Bilderna är tagna med en kamera som är ansluten till en spaltlampa under ett ljust fält och koboltblått filter). I 18/20 (90%) av ögonen, involverade neovaskularisation hela hornhinnans yta (Figur 1A). I 20/02 (10%), var neovaskularisering observerades i tre av fyra korneala kvadranter, men det fortfarande nått hornhinnans centrum.
För att validera utveckling LSCD, var hela berget immunfärgning utfördes ett. Detta steg är inte en del av protokollet och kan ändras beroende på mål och intressen. Tre variationer ansågs som indikatorer på LSCD: frånvaro av cytokeratin (CK) 12, ett mellanliggande filament som är specifik för normala hornhinneepitelceller 17, 18; utseende CK8, en enkel epitel markör
Normala, oskadade hornhinnor uttryck CK12-en specifik markör av mogna korneaepitelialceller 17, 18 -throughout hornhinnans yta, men de saknar CK8 eller bägarceller (MUC5AC) på hornhinnans del av hela berget prover (Figur 1B) . I jämförelse med normala ögon, är nästan frånvarande på injur CK12 uttryck y modell hornhinnor, medan de visar signifikant positiv färgning för CK8 och bägarceller (Figur 1B). Dessa observationer tyder på att utveckla LSCD.
Om du är intresserad av att kvantifiera immunfärgning resultat, använd bild J till separat kvantifiera 20 immunfärgning densiteter på de ursprungliga, oförändrade bilder tagna av mikroskop under samma inställningar. I korthet väljer hornhinnans del av hela berget provet mäter den integrerade densitet och området för denna region, och beräkna den korrigerade densiteten för bakgrunden 20. Förhållandet mellan CK12 till Ck8 densiteter tidigare presenterats på ett större antal prover 1. Den reducerade förhållande i jämförelse med kontroller (normala hornhinnor) och uppträdandet av bägarceller på hornhinnans yta visar utvecklingen av LSCD.
658 / 54658fig1.jpg "/>
Figur 1: hornhinnan fenotyp Efter skapa LSCD hos möss. Spaltlampa undersökning visar att alla hornhinnor utveckla en viss grad av kärlnybildning med en månad (A, Skala bar: 0,5 mm). En normal hornhinna uttrycker CK12 hela hornhinnan, men saknar CK8 eller bägarceller (MUC5AC). CK12 är frånvarande i LSCD modellen, medan CK8 och bägarceller synas på hornhinnan (B, Scale bar: 200 ^ m). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskriver en reproducerbar och relativt enkel teknik för att skapa en musmodell av LSCD. Det finns flera viktiga aspekter av denna modell som är värt att notera. Först, till skillnad från modeller som använder kemikalier 11, 12, skadan innebär främst ytan epitel (och basalmembran), med minimal skada på underliggande hornhinnestroma eller andra intraokulära strukturer. Det finns således endast begränsad inflammation och ärrbildning, som båda kan komplicera förfarandet och göra det svårare att bedöma resultatet av de eventuella åtgärder som syftar till limbala stamceller. En intressant ny studie av Li et al. 10, som jämför användningen av den roterande burr med olika kombinationer av kirurgiska och kemiska behandlingar, fann också burr att vara säkrare och mer effektiva för att skapa LSCD i kaniner. För det andra verkar modellen vara stabil under åtminstone upp till tre månader 1. Skapa denna modell innebär användning avroterande Burr, ett instrument som är bekant för kliniker som arbetar med hornhinnan, liksom för dem som gör mus sårskada studier. Dess fördel jämfört med ett trubbigt spatel är att skadan är mer enhetlig och reproducerbar en.
För att bättre förstöra limbus stamceller var limbal område som behandlas två gånger. Baserat på erfarenhet av att arbeta på mus ögon, behandling av mer än två omgångar ofta sliter limbala blodkärl och orsakar blödningar. I fall den teknik används i andra djur, kan detta steg modifieras beroende på hornhinnans epitel tjocklek. I denna studie var en motoriserad verktyg med en 0,5-mm burr spetsen utnyttjas; Burr tips i andra former och storlekar är också tillgängliga och kan användas i stället, beroende på hornhinnan specifikationer och på ögon storlek. Li et al. 10 rapporterade 2,5 mm Burr vara lämpliga att konsekvent ta kanin hornhinnan och limbus epitel.
För att erhålla den optimalaresultat, limbus och korneala epitelet rakades på ett cirkulärt sätt och den laterala sidan av burr användes. För att förhindra att djurhår från att störa verktygsspetsen ades povidonjod droppe sprids på håret runt ögat, i stället för att torkas av. Verktyget får inte användas statiskt på ett ställe, eftersom det kan orsaka perforering. Behandla limbus på en mycket långsam takt kan resultera i blödning; en hastighet på nästan 6 sek per tur är lämplig för en C57BL / 6J mus ögat. Det är viktigt att undvika åter borsta nakna stroma, eftersom detta kommer att leda till mer inflammation och stroma grumling. Trycket bör inte appliceras till ögat samtidigt som slipning epitelet. Efter ingreppet, var hornhinnan färgades med fluorescein färgämne för att se fullständig epitel borttagning. Det är viktigt att förhindra torra ögon under djur återhämtning. Begränsningar är att denna teknik inte kan ta bort 100% av stamcellema. Det är också något operatörsberoende och kräver övning för att ge consistent resultat.
När man studerar den korneaepitelet fenotyp, är hela berget färgning det bästa sättet att utvärdera resultatet av denna modell. Orsaken är att det gör att hela hornhinneepitelet som skall utvärderas på en gång, medan tvärsektioner skulle bara ge information om varje särskild sektion.
Denna reglerteknik kan inducera LSCD i möss, och förmodligen i andra djur också. Det ger en lämplig modell av LSCD att studera nya behandlingar och att upptäcka bredare aspekter av sjukdomen patofysiologi. Med vissa ändringar, kan det vara bra att studera hornhinnan sårläkning, angiogenes, och lymfangiogenes också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Ruth Zelkha, MS, för hennes generösa hjälp vid avbildning. Denna forskning stöds av kliniska forskare Development Program Award K12EY021475 till MIG, bevilja R01 EY024349-01A1 till ARD, core bidrags EY01792 från National Eye Institute, NIH, och en obegränsad bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet. ARD är mottagare av en karriärutvecklings Award från forskning till förhindrar blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover | Rumex International Co, Clearwater, FL | 16-141 | 0.5 mm burr. Also available from other companies. |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M691 | |
| Digital camera | Nikon, Thailand | ||
| Nikon FS-2 slit lamp | Nikon, Japan | ||
| Polyclonal anti-CK12 antibody | Santa Cruz Blotechnology, CA, | SC-17101 | 1:100 concentration |
| Monoclonal anti-CK8 antibody | TROMA-I-s, Iowa City, IA | AB_531826 | 1:50 concentration |
References
- Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
- Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
- Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
- He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
- Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
- Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
- Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
- Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
- Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
- Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
- Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
- Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
- McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).
