Un modello murino di Gruppo B<em> Streptococcus</em> Colonizzazione vaginale

Summary

Lo scopo di questo protocollo è di imitare gruppo umano B Streptococcus (GBS) la colonizzazione vaginale in un modello murino. Questo metodo può essere usato per studiare risposta immunitaria e fattori batterici contribuiscono GBS persistenza vaginale, nonché per testare strategie terapeutiche.

Abstract

Streptococcus agalactiae (streptococco di gruppo B, GBS), è un Gram-positivi, colonizzatore asintomatico del tratto gastrointestinale umano e del tratto vaginale del 10 – 30% degli adulti. Negli individui immunocompromessi, compresi i neonati, donne incinte e gli anziani, GBS può passare a un patogeno invasivo provocando sepsi, artrite, polmonite e la meningite. Perché GBS è un batterio patogeno leader di neonati, la profilassi corrente è composto di uno screening in ritardo di gestazione per GBS colonizzazione vaginale e la successiva terapia antibiotica peri-parto delle madri GBS-positivi. Heavy GBS onere vaginale è un fattore di rischio per entrambe le malattie neonatali e la colonizzazione. Purtroppo, poco si sa circa l'host e fattori batterici che incoraggiare o consentire GBS colonizzazione vaginale. Questo protocollo descrive una tecnica per stabilire persistente GBS colonizzazione vaginale utilizzando un unico β-estradiolo pre-trattamento e campionamento giornaliero per stabilire loa battericad. La comunicazione precisa inoltre particolari metodi per somministrare terapie o reagenti di interesse aggiuntivi e per raccogliere vaginale liquido di lavaggio e tessuti dell'apparato riproduttivo. Questo modello di topo favorirà la comprensione dell'interazione GBS-host all'interno dell'ambiente vaginale, che porterà a potenziali bersagli terapeutici per il controllo materno colonizzazione vaginale durante la gravidanza e per prevenire la trasmissione al neonato vulnerabili. Sarà anche essere di interesse per aumentare la nostra comprensione delle interazioni generali batterico-ospite nel tratto vaginale femminile.

Introduction

Streptococcus agalactiae, streptococco di gruppo B (GBS), è un incapsulato batterio Gram-positivi che spesso viene isolato dal intestino e tratto genito-urinario degli adulti sani. Nel 1970, GBS è emerso come l'agente principale di mortalità neonatale infettiva, con oltre 7.000 casi di malattia neonatale all'anno ^1. Precoce della malattia di GBS (EOD) si verifica nelle prime ore o giorni di vita, si pone come polmonite o distress respiratorio, e spesso si sviluppa in sepsi, mentre la malattia ad esordio tardivo (LOD) ne consegue dopo diversi mesi e si presenta con batteriemia, che spesso anticipi a meningite ^2. A partire dal 2002, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie raccomanda lo screening universale per GBS colonizzazione vaginale a fine gestazione e la profilassi antibiotica intrapartum (IAP) per le madri GBS-positivi ^1. Nonostante la riduzione della malattia ad esordio precoce a circa 1.000 casi negli Stati Uniti ogni anno a causa di IAP,GBS rimane la principale causa di sepsi neonatale ad esordio precoce e tardiva comparsa rimane inalterato ^1. Sia in utero, durante il travaglio, o anche nei casi ad esordio tardivo, l'esposizione neonatale a GBS richiede la sopravvivenza, trasversale attraverso una serie di ambienti e barriere di accoglienza, evasione immune, e, nel caso di meningite, attraversamento del sangue- altamente regolamentato encefalica ^2. A monte di queste interazioni virulenti nel neonato è la colonizzazione iniziale del tratto vaginale materno. Materna GBS tassi di colonizzazione vaginale vanno 8-18% nei paesi sviluppati e in via di sviluppo, con un tasso medio stimato del 12,7% ^3,4. GBS colonizzazione del tratto vaginale durante la gravidanza può essere costante, intermittente, o di natura transitoria tra singole donne ^5. È interessante notare che, a materni di età> 36 anni è associata con la colonizzazione persistente ^6. Numerosi fattori di rischio biologici e socio-economici per la colonizzazione GBS vaginaleè stato identificato. Fattori biologici includono gastrointestinale colonizzazione GBS e l'assenza di Lactobacillus all'interno dell'intestino. Tuttavia, l'etnia, l'obesità, l'igiene e l'attività sessuale sono stati anche associati con GBS trasporto vaginale ^7.

Anche se noti per causare infezioni neonatali, GBS provoca anche una varietà di infezioni materne sia peri-parto e dopo il parto. GBS carrello viene aumentata in donne che presentano una vaginiti ⁸ e, in alcuni casi, può anche essere l'entità della malattia ^9. Inoltre, GBS ascensione del tratto riproduttivo durante la gravidanza può causare infezioni intra-amniotico o corionamnionite ^10. Inoltre, fino al 3,5% delle gravidanze, GBS diffonde alla vescica urinaria per provocare una infezione delle vie urinarie o batteriuria asintomatica ^11. bacteriuria GBS durante la gravidanza è associato ad un aumentato rischio di febbre intrapartum, corionamnionite, parto prematuro, e premature rottura delle membrane ^12. Presi insieme, la presenza di GBS nel tratto vaginale è legata ad infezioni di più tessuti dell'ospite, e la capacità di eliminare GBS da questa nicchia è fondamentale per la salute materna e neonatale.

Fino a poco tempo, la maggior parte del lavoro esaminare interazioni GBS con il tratto cervicovaginale era limitato a modelli cellulari in vitro ^13-15. Questi esperimenti in vitro hanno rivelato fattori batterici che sono importanti per l'adesione, tra cui proteine di superficie come una pili e ricco di serina ripete ^17,18, così come i sistemi di regolazione a due componenti ^15,19 e la risposta trascrizionale globale dell'epitelio vaginale GBS ^19. Tuttavia, per chiarire completamente le interazioni ospite-microbo all'interno del tratto vaginale, un modello animale robusto è necessario. I primi lavori hanno dimostrato che GBS può essere recuperato dal tratto vaginale di topi inoculati ^20,21 e ratti <sup> 22 sia in condizioni di gravidanza e non gravide. Nel 2005, a breve termine la colonizzazione GBS vaginale è stato modellato nei topi per esaminare l'efficacia di un enzima fago litico per il trattamento di GBS vaginale nel corso di un periodo di 24 ore ^23. Diversi anni dopo, un modello di topo GBS colonizzazione vaginale a lungo termine è stato sviluppato per studiare i fattori di accoglienza e batteriche che disciplinano GBS persistenza. Questo modello ha identificato numerosi fattori che contribuiscono alla GBS colonizzazione, comprese le appendici superfici ^17,18 e GBS sistemi a due componenti ^19,24. Questo modello ha contribuito alla identificazione dei meccanismi di risposta dell'ospite ^19,25 ed è stato utilizzato per testare diverse strategie terapeutiche, tra cui peptidi immunomodulatori ²⁶ e probiotici ^27. Questo protocollo fornisce le indicazioni necessarie per inoculare GBS nel tratto vaginale mouse e per monitorare successivamente colonizzazione e raccogliere campioni per ulteriori analisi.

Protocol

Tutto il lavoro animale è stato approvato dall'Ufficio di Lab Animal Care a San Diego State University e condotta sotto gli standard veterinari riconosciuti. Topi femmina, età 8 – 16 settimane, sono stati utilizzati per lo sviluppo di questo metodo. 1. Preparazione e intraperitoneale Iniezione di β-estradiolo Misurare β-estradiolo (0,5 mg / topo) su carta pesare indossando dispositivi di protezione adeguati (DPI). ATTENZIONE: β-estradiolo può essere assorbito attraverso la p…

Representative Results

Durante lo sviluppo di questo modello, sono state fatte diverse osservazioni per quanto riguarda i fattori che influenzano la durata della GBS colonizzazione vaginale. Per determinare fase estrale come ad impatti di inoculazione GBS persistenza batterica, i topi sono stati in scena il giorno della inoculazione mediante liquido di lavaggio vaginale. La Figura 1 illustra le quattro fasi del ciclo estrale mouse, come determinato da wet-montare liquido di lavaggio vaginale, …

Discussion

Per promuovere l'avanzamento della comprensione delle interazioni GBS con lo sia l'host e altri microbi nell'ambito dell'ospite, è necessario un modello animale. Questo lavoro descrive gli aspetti tecnici di stabilire GBS colonizzazione vaginale nei topi. Questo protocollo raggiunge> 90% colonizzazione topi senza l'uso di anestetici per inoculare i batteri o per raccogliere campioni di tampone, immuno-soppressori per consentire la colonizzazione, vaginale prelavaggio, o additivi per addensare l&#…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV