Мы сообщаем быстрый и эффективный способ редактирования гена , основанный на RMCE в AAVS1 локуса плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) , который усовершенствует ранее описанных системах. С помощью этого метода, изогенных линий могут быть быстро и надежно генерироваться для собственных сравнительных исследований, содействие Трансгенез-опосредованного исследования с hPSCs.
Даже с революцией генных таргетирования технологий во главе с CRISPR-cas9, генетической модификации человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) по – прежнему занимает много времени. Сравнительные исследования, которые используют рекомбинантные линии с трансгенов интегрированы в безопасной гавани локусов может извлечь выгоду из подходов, которые используют сайт-специфических целевых рекомбиназ, как Cre или FLPe, которые являются более быстрым и менее склонны к вне целевых эффектов. Такие способы были описаны, хотя они этого не делают значительно опережать ген таргетирования в большинстве аспектов. Использование нуклеазы цинка пальцами, ранее мы создали линию мастер – клеток в AAVS1 локус hPSCs , который содержит GFP-гигромицину тк , выражающую кассету, по бокам гетеротипичной последовательностей FRT. Здесь мы описываем процедуры для выполнения FLPe рекомбиназа-опосредованного обмена кассета (RMCE), используя эту строку. Мастер сELL линия трансфицируют вектором донора RMCE, который содержит пуромицин сопротивление без промотора, и с FLPe рекомбиназы. Применение как программы селекции положительный (Пуромицин) и отрицательные (ФИАУ) приводит к выбору RMCE без случайных интеграций. RMCE генерирует полностью охарактеризован плюрипотентных поликлональные трансгенные линии в 15 г с 100% эффективностью. Несмотря на недавно описал ограничения AAVS1 локуса, легкость системы прокладывает путь к HPSC трансгеноза в изогенных настройках, необходимо для проведения сравнительных исследований, а также позволяет полу-высокой пропускной способности генетические экраны для усиления / потери функционального анализа , который бы в противном случае отнимает много очень много времени.
Целенаправленное генома рекомбинации способствовало быстрое развитие во многих областях исследований. У мышей, синергия между редактирования генома и исследования стволовых клеток позволило добиться более глубокого понимания сложного механизма функции генов и регуляции генов. Такой прогресс, как ожидается, в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), а также, хотя и в течение многих лет с момента первого выделения эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК), а затем и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), редактирование ген представляет собой технический барьер , Последние достижения в области генной инженерии с использованием целевых нуклеазы-цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Talen) или кластерной регулярно interspaced короткий палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR / cas9) позволили нам преодолеть эти трудности, делая целевой рекомбинации эффективный процесс 1 – 3.
Удельная локусы в мУз генома , которые позволяют стабильную, надежную и повсеместное экспрессию трансгена в отсутствие побочных эффектов , таких как Rosa26, Hprt1 или COL1A1, стали важными инструментами в выполнении генетических исследований. Safe Harbor локусы позволяют сравнительный анализ между различными линиями мышей в изогенных контекстах. Это не может быть достигнуто с использованием стандартных методов случайной интеграции, которые связаны с известными ограничениями, как инсерционного мутагенеза, дозозависимое эффектов или пестрой экспрессии трансгена. Джин редактирования легкость и гибкость в безопасной гавани локусов увеличивается за счет использования конкретных участков целевых рекомбиназ как Cre или флиппазы (FLPe), которые специфически распознают последовательности-мишени (LoxP или FRT, соответственно) и катализируют эффективной рекомбинации между идентичными целям. Благодаря этим характеристикам, рекомбиназа-опосредованной редактирование гена с использованием LoxP или FRT последовательности в предварительно интегрированных безопасной гавани локусов является обычным инструментом, используемым в транс мышигенеза. В дополнение к вставке кассеты или иссечения опосредованного между идентичными последовательностями – мишенями, использование несовместимых LoxP или FRT сайтов позволяет рекомбинантному-опосредованный обмен кассеты (RMCE) 4.
У человека, пытается определить безопасные локусы гавань проводились. Мышь ортологичными HPRT, несмотря на ассоциацию с Леша-Nyhan синдром с потерей функции и ROSA26 были направлены в hPSCs. HPRT сообщалось быстро заглушить экспрессию трансгена в ESC и, как ROSA26, его способность поддерживать экспрессию трансгена в терминально дифференцированных клеток не было исследовано 5 – 7. Поскольку гомозиготные нулевая мутация гена CCR5 , как представляется, хорошо переносится в организме человека, его ценность в качестве безопасной гавани была оценена. CCR5 была направлена и сообщил , чтобы поддерживать стабильную экспрессию трансгенов в различных клеточных линиях человека, в том числе ESCs 8,9. Однако,последняя не была доказана на клоновых уровне в течение долгосрочного культуры, и экспрессия вездесущи трансген не была продемонстрирована в дифференцированном потомстве трех зародышевых слоев. AAVS1, сайт естественная интеграция Адено связанного типа Вирус 2 (AAV), был протестирован в ЭСК , а также, из – за о резистентности к воздействию трансгенов глушителей 10. Позже, многие группы использовали локус AAVS1 и описал стабильную экспрессию трансгенов в недифференцированных hPSCs, а также в их дифференцированное потомство всех трех зародышевых листков, как в пробирке и в естественных условиях 2,8,11,12. Недавние результаты , тем не менее Nuance эти выводы, как было обнаружено , что локус AAVS1 оказывать переменное ингибирование трансгенов в пробирке в недифференцированных ЭСК и гепатоцитов потомстве 13.
Дополнительные исследования скрининга с использованием случайных подходов и методов интеграции, чтобы определить единую интеграцию копирования с целью поиска Геномикрофонные сайтов интеграции , устойчивые к трансгенов глушителей в процессе расширения и дифференциации 14,15 hPSCs. В целом, до сих пор ни один геномный сайт не был полностью подтверждено в качестве безопасной гавани в hPSCs и их потомству; идентификация соответствующего сайта для повсеместного стабильной экспрессии трансгенов, не только в hPSCs , но и в их потомстве дифференцированных в пробирке и в естественных условиях, еще предстоит решить. Среди всех изученных локусов и , несмотря на свою ограниченность, AAVS1 остается самым охарактеризован и наиболее часто используемых в исследованиях стволовых клеток.
RMCE была успешно проведена в hPSCs в некоторых из этих локусов 6,7,14,16, используя в основном Cre рекомбиназу, даже если есть признаки того, что FLPe более эффективен , чем Cre 17. Во всех этих случаях, один положительный кассета устойчивости к лекарственному средству была использована для отбора рекомбинантных колоний. Несмотря на успех, эти процедуры не представляют собой технический прогресс по сравнению со стандартными генноредактирования процедуры с использованием ZFNs, Таленс или CRISPR / cas9, как единый антибиотик процедура отбора не исключает случайных интеграций и требует скрининга колонии, чтобы правильно идентифицировать целевых клонов.
В этой процедуре, мы опишем методы для выполнения RMCE в hPSCs в на AAVS1 локуса с использованием комбинации положительных ( в пределах входящего кассеты) и отрицательный ( в пределах предварительно интегрированные кассеты) выборы , которые позволяют для генерации поликлональных трансгенных линий в ± 15 дней с КПД 100% и свободным от случайных событий интеграции. Таким образом, этот метод представляет собой прогресс за пределами описанных в настоящее время RMCE технологий в hPSCs.
методы редактирования генов в безопасные гавани локусам остаются важным инструментом для разработки трансгенеза в hPSCs. Хотя безопасная гавань характер AAVS1 недавно была поставлена под сомнение в некоторых приложениях 13,18, этот локус в настоящее время остается лучшим в характеризуется человеческих клеточных линий , полученных. Осознание своих ограничений в hPSCs может помочь получить достоверные данные. Поэтому AAVS1 по – прежнему ожидается, будет полезный сайт, например, для амплитудно и с потерей функции исследований или индуцируемого / конститутивной экспрессии факторов , которые требуют изогенных контекст внутри и между определенными генетическими фонов.
AAVS1 локус был мишенью многих групп с использованием ZFNs, Talen или CRISPR / cas9 1,2,19. Эти нуклеазы значительно повысить эффективность гомологической рекомбинации в определенном локусе. Тем не менее, процесс проверки и полностью характеризуют правильно ориентированные клоны, свободные от случайного INTEGрацион и для поддержания плюрипотентности и геном целостности может занять до 3 -х месяцев ( с использованием оптимизированных инструментов редактирования генов) (рисунок 3). Последние два могут быть вызваны возможных мутаций, порожденных нуклеазы активности за пределами целевой. Система RMCE используется здесь, однако, предлагает быстрый, эффективный и элегантный способ для достижения этой цели всего за две недели после того , как рекомбинантному конкретные целевые последовательности предварительно интегрированные в AAVS1 локуса. Использование положительного / отрицательного отбора и соответствующей программы отбора являются основными факторами , способствующими упрощения редактирования генов в локусе AAVS1 по RMCE.
Генотипическая характеристика новых трансгенных линий значительно снижается (не клоновая скрининг не требуется), а также характеристики, связанные с грязно-мишени нуклеазная активность оказывается необязательной из-за специфики FLPe для FRTS. Характеристика также может быть снижена в обычных экспериментах RMCE, демонстрируяполная потеря экспрессии GFP из мастер – клеточной линии (рис 2А), так как полная замена кассеты и отсутствие случайной интеграции уже достаточно продемонстрирована с помощью ПЦР (фиг.2В) и Саузерн – блот – 13. Использование положительного / отрицательного отбора также составляет основную разницу с предыдущими отчетами. Несколько групп , которые ранее описанные RMCE в hPSCs, либо в AAVS1 или других локусах, использовали только один позитивный шаг выбора 7,14,16. Это не представляет собой основные технические преимущества по сравнению с редактированием гена, выполняемой с нуклеаз, потому что скрининг колонии должен быть в равной степени выполняться для того, чтобы продемонстрировать правильную интеграцию и отсутствие случайной интеграции на клонального уровне.
Использование этой системы RMCE в нескольких чЭСК / IPSC линий требует preintegration описанного FRT-содержащего кассету в AAVS1 локуса каждой независимой линии. Тем не менее, как только генерируется,его быстрота и простота позволяет развивать полу высокую пропускную способность генетических экранов в определенных изогенных настроек для приложений, упомянутых выше, которые в противном случае были бы технически очень много времени. Кроме того, все векторы RMCE построены в векторе рЪ AAVS1 ген-таргетинга , используемый для целевой локус с ZFNs, но Таленс или CRISPR / cas9 были также зарегистрированы. двойственности RMCE вектора является весьма полезным для создания нескольких линий для определенного трансгена в hPSCs с или без FRT. Например, один удар продемонстрировал успех в определенном генетическом скрининге, проведенного RMCE в идеале должны были бы быть проверены в нескольких строках HPSC для подтверждения результатов. При отсутствии нескольких RMCE-пригодных линий клетки-хозяина, прямой ген нацеливание удара с использованием нуклеазы может быть выполнена. Полезность двойственного характера векторов RMCE было доказано нашей группой 20. В этом исследовании, коррекция гена проводилась в пациенте полученныхЛобно – височная деменция (FTD) иПСК , которые несут мутацию вызывает PROGRANULIN (PGRN) выражение дефицита. Ген комплементационный по ZFNs-опосредованной вставки в AAVS1 локуса кассеты , что восстановленный PGRN уровней, исправлены дефектный фенотип в corticogenesis , связанной с наличием мутации. Кроме того, сопоставимое линия была сгенерирована с помощью RMCE в WT ЭСК для использования в качестве контроля для экзогенной PGRN выражения.
При отсутствии рекомбинантных колоний, проверить эффективность трансфекции вектора-донора RMCE. эффективность трансфекции, превосходящие 30% -ным выходом, результаты которого приведены выше. Снижение эффективности трансфекции уменьшают эффективность рекомбинации. И, наконец, система RMCE была сформирована в локусе AAVS1, но оно применимо к любым другим локусом.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |