نحن هنا الإبلاغ عن طريقة تحرير الجين السريع والفعال على أساس RMCE في موضع AAVS1 من الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية (hPSCs) أن يحسن على النظم التي سبق وصفها. باستخدام هذه التقنية، وخطوط إسوي يمكن أن تتولد بسرعة وبشكل موثوق للدراسات المقارنة الصحيحة، وتسهيل البحوث بوساطة transgenesis مع hPSCs.
حتى مع ثورة التكنولوجيا التي تستهدف الجينات التي كريسبر-Cas9، التعديل الوراثي للخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) قاد لا يزال الوقت طويلا. الدراسات المقارنة التي تستخدم خطوط المؤتلف مع الجينات المحورة دمجها في مواضع ملاذ آمن يمكن أن تستفيد من النهج التي تستخدم recombinases استهدفت مواقع محددة، مثل لجنة المساواة العرقية أو FLPe، والتي هي أكثر سرعة وأقل عرضة للآثار بعيدا عن الهدف. وقد وصفت هذه الأساليب، على الرغم من أنها لا كبير الجينات يتفوق تستهدف في معظم الجوانب. باستخدام nucleases الزنك، الاصبع، أنشأنا سابقا خط الخلايا الرئيسية في موضع AAVS1 من hPSCs التي تحتوي على GFP-هيغروميسين-TK التعبير كاسيت، ويحيط بها سلاسل FRT غيروي. هنا، نحن تصف الإجراءات لأداء FLPe بوساطة recombinase الصرف كاسيت (RMCE) باستخدام هذا الخط. سيد جوtransfected خط الذراع مع ناقل RMCE المانحة، والذي يحتوي على promoterless المقاومة بوروميسين، ومع FLPe recombinase. تطبيق كل من برنامج اختيار إيجابية (بوروميسين) والسالب (FIAU) يؤدي إلى اختيار RMCE دون التكامل عشوائية. RMCE يولد خطوط المعدلة وراثيا بولكلونل المحفزة السمات التي تميزت بشكل كامل في 15 د بكفاءة 100٪. وعلى الرغم من وصف مؤخرا القيود المفروضة على موضع AAVS1، وسهولة النظام تمهد الطريق لtransgenesis hPSC في إعدادات إسوي، أمر ضروري للدراسات المقارنة، وتمكن شاشات الوراثية شبه عالية الإنتاجية لتحقيق مكاسب / خسائر في تحليل الوظيفة التي لولاها يكون الوقت قد حان للغاية طويلا.
وقد سهلت استهدفت إعادة التركيب الجينوم التقدم السريع في العديد من مجالات البحث. في الفئران، سمح التآزر بين تحرير الجينوم وأبحاث الخلايا الجذعية لزيادة فهم آلية معقدة من وظيفة الجين وتنظيم الجينات. ومن المتوقع هذا التقدم في خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs) وكذلك، على الرغم من أن لسنوات عديدة منذ عزل أول من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، ولاحق من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، والتحرير الجين قد يشكل عقبة التقنية . التطورات الحديثة في مجال الهندسة الجينية باستخدام nucleases والزنك المستهدفة فنجر Nucleases (ZFNs)، النسخ، مثل المنشط nucleases المستجيب (TALEN)، أو مجمع interspaced بانتظام باختصار يكرر المتناوب المرتبطة كريسبر البروتين 9 (كريسبر / Cas9) سمحت / لنا للتغلب على هذه الصعوبات، مما يجعل استهدفت إعادة التركيب عملية فعالة 1-3.
مواضع محددة في مأصبحت [أوس] الجينوم التي تسمح مستقرة وموثوق بها، في كل مكان والتعبير التحوير في عدم وجود آثار سلبية مثل Rosa26، Hprt1، أو Col1A1، أدوات أساسية في أداء الدراسات الجينية. مواضع الملاذ الآمن تسمح تحليل للمقارنة بين خطوط مختلفة من الفئران في سياقات إسوي. لا يمكن أن يتحقق ذلك باستخدام أساليب التكامل عشوائي القياسية، والتي ترتبط مع القيود المعروفة مثل الطفرات إقحامي، والآثار التي تعتمد على الجرعة، أو التعبير التحوير التلون. يتم زيادة الجين التحرير سهولة ومرونة في مواضع ملاذ آمن من خلال استخدام recombinases استهدفت مواقع محددة مثل لجنة المساواة العرقية أو Flippase (FLPe)، والتي تعترف على وجه التحديد تسلسل الهدف (loxP أو FRT، على التوالي)، وتحفيز إعادة التركيب الفعال بين الأهداف متطابقة. ونظرا لهذه الخصائص، والتحرير الجينات بوساطة recombinase باستخدام loxP أو FRT تسلسل في preintegrated مواضع الملاذ الآمن هو أداة شائعة تستخدم في الماوس العابرسفر التكوين. بالإضافة إلى إدراج كاسيت أو الختان بوساطة بين تسلسل الهدف متطابقة، واستخدام loxP أو FRT مواقع تتعارض يسمح لتبادل كاسيت بوساطة recombinase (RMCE) 4.
في الإنسان، ومحاولات لتحديد أجريت مواضع الملاذ الآمن بها. وHPRT orthologous الماوس، على الرغم من ارتباطه ليش-نيهان متلازمة فقدان وظيفة، وROSA26 استهدفوا في hPSCs. وذكرت HPRT لإسكات بسرعة التعبير التحوير في ESC، ومثل ROSA26، قدرتها على المحافظة على التعبير التحوير في عضال خلايا متباينة لم يكن التحقيق 5-7. بسبب ظهور طفرة اغية متماثل من الجين CCR5 أن تحملها جيدا في البشر، وجرى تقييم قيمته بوصفه الملاذ الآمن. وقد استهدف CCR5 وذكرت للحفاظ على التعبير التحوير مستقر في مختلف خطوط الخلايا البشرية، بما في ذلك المجالس الاقتصادية والاجتماعية 8،9. ومع ذلك،لم يثبت هذا الأخير على مستوى نسيلي خلال ثقافة على المدى الطويل، وكان لم يثبت التعبير التحوير في كل مكان في ذرية متباينة من الطبقات الجرثومية الثلاث. AAVS1، موقع التكامل الطبيعي للغدة أسوشيتد نوع الفيروس 2 (AAV)، تم اختباره في hESCs كذلك، بسبب مقاومة إبلاغ التحوير إسكات 10. وفي وقت لاحق، وتستخدم العديد من المجموعات موضع AAVS1 وصفت التعبير التحوير مستقر في hPSCs غير متمايزة، وكذلك في ذرية متباينة، من كل الطبقات الجرثومية الثلاث، سواء في المختبر والمجراة 2،8،11،12. النتائج الأخيرة على الرغم من ذلك الوضوح هذه النتائج، كما تم العثور على مكان AAVS1 إلى بذل تثبيط التحوير متغير في المختبر في hESCs غير متمايزة وفي الكبدية ذرية 13.
دراسات فرز إضافية باستخدام نهج التكامل العشوائية وأساليب لتحديد التكامل نسخة واحدة تهدف إلى إيجاد GENOمواقع التكامل هيئة التصنيع العسكري مقاومة لإسكات التحوير خلال التوسع hPSCs والتمايز 14،15. وعموما، حتى الآن، تم التحقق من صحة أي موقع الجيني الكامل باعتباره الملاذ الآمن في hPSCs وذريتها. تحديد الموقع المناسب لفي كل مكان التعبير التحوير مستقر، وليس فقط في hPSCs ولكن أيضا في السلالات متباينة في التجارب المختبرية والحية، لا يزال يتعين حلها. ومن بين جميع مواضع درس، وعلى الرغم من قصوره، يبقى AAVS1 وأفضل وصف والأكثر استخداما في بحوث الخلايا الجذعية.
وقد تم تنفيذ RMCE بنجاح في hPSCs في بعض من هذه المكاني 6،7،14،16 غالبا باستخدام recombinase لجنة المساواة العرقية، حتى لو كانت هناك دلائل تشير إلى أن FLPe هو أكثر كفاءة من لجنة المساواة العرقية 17. في كل هذه الحالات، تم استخدام واحد مقاومة إيجابية عقار كاسيت لاختيار المستعمرات المؤتلف. على الرغم من نجاح، وهذه الإجراءات لا تشكل تقدما تقنيا على مستوى gene-إجراءات التحرير باستخدام ZFNs، TALENs أو كريسبر / Cas9، وإجراءات اختيار المضادات الحيوية واحد لا يستبعد التكامل العشوائية ويتطلب فحص مستعمرة لتحديد استنساخ المستهدفة بشكل صحيح.
في هذا الإجراء، وصفنا طرق لأداء RMCE في hPSCs في موضع AAVS1 باستخدام مزيج من الموجب (داخل كاسيت واردة) والسالب (داخل الكاسيت preintegrated) التحديدات التي تسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا بولكلونل في ± 15 يوما مع كفاءة 100٪ وخالية من الأحداث التكامل عشوائية. ولذلك، تمثل هذه الطريقة تقدم وراء التقنيات RMCE وصفها حاليا في hPSCs.
لا تزال أساليب تحرير الجينات في مواضع الملاذ الآمن أداة أساسية لتطوير transgenesis في hPSCs. وعلى الرغم من الطابع الملاذ الآمن من AAVS1 تم مؤخرا استجواب لبعض التطبيقات 13،18، لا يزال هذا موضع حاليا أفضل وصف في خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان. الوعي حدودها في hPSCs يمكن أن تساعد في الحصول على بيانات موثوقة. لذلك، لا يزال من المتوقع أن يكون الموقع مفيدا، على سبيل المثال، للدراسات gain- وفقدان وظيفة، أو محرض / التعبير التأسيسي من العوامل التي تتطلب سياق إسوي داخل وبين خلفيات وراثية مصممة AAVS1.
وقد استهدفت مكان AAVS1 من قبل جماعات عديدة باستخدام ZFNs، TALEN أو كريسبر / Cas9 1،2،19. هذه nucleases زيادة كبيرة في كفاءة إعادة التركيب مثلي في مكان المحدد. ومع ذلك، فإن عملية غربلة وتميز تماما استنساخ المستهدفة بشكل صحيح، وخالية من INTEG عشوائيالتموينية وللحفاظ على تعدد القدرات والجينوم النزاهة قد يستغرق ما يصل إلى 3 أشهر (باستخدام الأمثل أدوات التحرير الجينات) (الشكل 3). الأخيرين يمكن أن تسببها الطفرات المحتملة الناتجة عن النشاط نوكلياز بعيدا عن الهدف. النظام RMCE المستخدمة هنا، ومع ذلك، يوفر طريقة سريعة وفعالة، وأنيقة لتحقيق هذا الهدف في غضون أسبوعين فقط، بمجرد preintegrated تسلسل المستهدفة recombinase محددة في موضع AAVS1. استخدام إيجابية / سلبية اختيار وبرنامج اختيار المناسب هي العوامل الرئيسية التي تسهم في تبسيط التحرير الجين في موضع AAVS1 التي كتبها RMCE.
يتم تقليل التوصيف الوراثي للخطوط المعدلة وراثيا الجديدة بشكل ملحوظ (أي فحص نسيلي ضروري)، وتوصيف المرتبطة بالنشاط نوكلياز بعيدا عن الهدف يتم تقديم الاستغناء عنها نظرا لخصوصية FLPe لFRTs. ويمكن أيضا أن يتم تخفيض توصيف في التجارب RMCE الروتينية من قبل مما يدل علىخسارة كاملة للتعبير GFP من خط الخلية الرئيسي (الشكل 2A)، لأن الصرف كاسيت الكامل وعدم الاندماج عشوائي سبق أن أثبتت بما فيه الكفاية من قبل PCR (الشكل 2B) واللطخة الجنوبية (13). يشكل استخدام إيجابية / سلبية اختيار أيضا الفرق الرئيسي مع التقارير السابقة. العديد من الجماعات التي سبق وصفها RMCE في hPSCs، سواء في AAVS1 أو غيرها من مواضع، استخدمت فقط مجموعة مختارة خطوة إيجابية واحدة 7،14،16. هذا لا يشكل ميزة التقنية الرئيسية على تحرير الجين يؤديها مع nucleases، لفحص مستعمرة لابد من تنفيذها على قدم المساواة من أجل إظهار التكامل الصحيح وغياب التكامل عشوائية على مستوى نسيلي.
استخدام هذا النظام RMCE في عدة HESC خطوط / IPSC يتطلب preintegration من وصف FRT التي تحتوي على الكاسيت في موضع AAVS1 كل سطر مستقل. ومع ذلك، ولدت مرة واحدة،سرعة وبساطته يجعل من الممكن لتطوير شاشات الوراثية شبه عالية الإنتاجية في إعدادات إسوي المحددة لتقديم الطلبات المذكورة أعلاه التي لولاها يكون الوقت قد حان للغاية من الناحية الفنية المستهلكة. وبالإضافة إلى ذلك، هي التي شيدت جميع ناقلات RMCE داخل ناقلات استهداف الجين أسما AAVS1 استخدامها لاستهداف موضع مع ZFNs، ولم يبلغ عن TALENs أو كريسبر / Cas9 أيضا. ازدواجية متجه RMCE هي مفيدة للغاية لتوليد خطوط متعددة لالتحوير العزم في hPSCs مع أو بدون FRT. على سبيل المثال، ضربة واحدة أثبتت نجاحا في شاشة الوراثية الحثيثة التي يبذلها RMCE سيحتاج مثالي لفحصها في خطوط hPSC متعددة لتأكيد النتائج. في غياب العديد من خطوط الخلايا الماجستير-RMCE مناسبة، الجين المباشر استهداف للضرب باستخدام nucleases يمكن أن يؤديها. وقد ثبت فائدة الطابع المزدوج للناقلات RMCE مجموعتنا 20. في هذه الدراسة، تم إجراء تصحيح الجين في المستمدة المريضالخرف الجبهي الصدغي (الخرف الجبهي الصدغي) iPSCs التي تحمل طفرة مسببة PROGRANULIN (PGRN) نقص التعبير. تكامل الجينات التي الإدراج بوساطة ZFNs في موضع AAVS1 من الكاسيت الذي أعاد مستويات PGRN، تصحيح النمط الظاهري عيب في corticogenesis المرتبطة جود طفرة. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خط مماثل من قبل RMCE في hESCs WT لاستخدامها لمراقبة التعبير PGRN خارجي.
في حالة عدم وجود المستعمرات المؤتلف، والتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن من ناقلات RMCE المانحة. الكفاءة ترنسفكأيشن متفوقة على 30٪ تسفر عن النتائج المشار إليها أعلاه. الكفاءة ترنسفكأيشن أقل انخفاض كفاءة إعادة التركيب. وأخيرا، تم إنشاء نظام RMCE في موضع AAVS1، ولكن ذلك ينطبق على أي مكان آخر.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |