Qui riportiamo un metodo di modifica genetica rapida ed efficiente in base RMCE nel locus AAVS1 di umani cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che migliora i sistemi precedentemente descritti. Usando questa tecnica, linee isogeniche possono essere rapidamente e affidabile generati per adeguati studi comparativi, facilitando la ricerca transgenesi mediata con hPSCs.
Anche con la rivoluzione delle tecnologie gene targeting guidati da CRISPR-Cas9, la modificazione genetica delle cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è ancora in tempo. Studi comparativi che utilizzano linee ricombinanti con transgeni integrati in loci porto sicuro potrebbero beneficiare di approcci che utilizzano ricombinasi mirati site-specific, come Cre o FLPE, che sono più rapidi e meno incline agli effetti esce a lato. Sono state descritte Tali metodi, pur non significativamente gene outperform targeting in molti aspetti. Utilizzando nucleasi zinc-finger, abbiamo precedentemente creato una linea cellulare maestro nel locus AAVS1 di hPSCs che contiene una GFP-Hygromycin-tk esprimere cassetta, affiancato da sequenze FRT eterotipica. Qui, si descrivono le procedure per eseguire FLPE scambio cassetta recombinase-mediata (RMCE) utilizzando questa linea. Il Master Clinea ell è trasfettate con un vettore RMCE donatore, che contiene un promoterless resistenza puromicina, e con FLPE ricombinasi. Applicazione di entrambi programma di selezione positiva (puromicina) e negativo (FIAU) porta alla selezione di RMCE senza integrazioni casuali. RMCE genera pienamente caratterizzato pluripotenti linee transgeniche policlonali in 15 d con un'efficienza del 100%. Nonostante le limitazioni del locus AAVS1 recentemente descritto, la facilità del sistema apre la strada per HPSC transgenesi nelle impostazioni isogenici, è necessario per gli studi comparativi, e consente schermi genetici semi-high-throughput per guadagno / perdita di analisi funzione che sarebbe altrimenti essere molto tempo.
Mirata ricombinazione del genoma ha facilitato rapidi progressi in molti settori della ricerca. Nei topi, la sinergia tra la modifica del genoma e ricerca sulle cellule staminali ha permesso una maggiore comprensione del complesso meccanismo della funzione del gene e la regolazione genica. Tale progresso è previsto in cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) e, anche se per molti anni da quando il primo isolamento di cellule staminali embrionali umane (hESC), e successivamente indotto umano cellule staminali pluripotenti (hiPSCs), la modifica genetica ha costituito un ostacolo tecnico . I recenti progressi nel campo dell'ingegneria del genoma utilizzando nucleasi-zinco mirati Finger nucleasi (ZFNs), trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talen), o cluster regolarmente intercalare breve ripete palindromiche / CRISPR-proteina associata 9 (CRISPR / Cas9) ci hanno permesso di superare queste difficoltà, facendo mirati ricombinazione un processo efficiente 1-3.
loci specifica nel mOuse genoma che permettono l'espressione del transgene stabile, affidabile, e onnipresente in assenza di effetti negativi, come Rosa26, Hprt1 o COL1A1, sono diventati strumenti essenziali nella realizzazione di studi genetici. loci di porto sicuro consentono l'analisi confrontabili tra le diverse linee di topi in contesti isogenici. Ciò non può essere ottenuto utilizzando metodi di integrazione casuale standard, che sono associati con limitazioni ben note come mutagenesi inserzionale, effetti dose-dipendente, o l'espressione del transgene variegata. Gene editing facilità e flessibilità nella loci porto sicuro è aumentata attraverso l'uso di ricombinasi mirati site-specific come Cre o flippase (FLPE), che riconoscono specificamente sequenze bersaglio (loxP o FRT, rispettivamente) e catalizzano efficiente ricombinazione tra obiettivi identici. Grazie a queste caratteristiche, la modifica genetica recombinase mediata utilizzando loxP o FRT sequenze in preintegrate loci Safe Harbor è uno strumento comunemente usato nel topo transgenesi. Oltre all'inserimento cassetto o escissione mediata tra sequenze bersaglio identici, l'uso di siti loxP o FRT incompatibili consente uno scambio cassette ricombinasi-mediata (RMCE) 4.
Nell'uomo, i tentativi di identificare loci approdo sicuro sono state effettuate. Il HPRT orthologous del mouse, nonostante la sua associazione con la sindrome della perdita-di-funzione di Lesch-Nyhan, e ROSA26 sono stato preso di mira in hPSCs. HPRT è stato segnalato per mettere a tacere rapidamente l'espressione del transgene nel ESC e, come ROSA26, la sua capacità di sostenere l'espressione del transgene nel terminale cellule differenziate non è stato studiato 5-7. Perché un null mutazione omozigote del gene CCR5 sembra essere ben tollerato nell'uomo, il suo valore come porto sicuro è stata valutata. CCR5 stato preso di mira e segnalato per sostenere l'espressione del transgene stabile in diverse linee cellulari umane, tra cui CES 8,9. Però,quest'ultimo non è stato dimostrato a livello clonale durante la coltura a lungo termine, e l'espressione ubiquitaria transgene non è stata dimostrata in progenie differenziata dei tre strati germinali. AAVS1, il sito di integrazione naturale del adeno associati tipo Virus 2 (AAV), è stato testato in hESC così, a causa di resistenza riferito a transgene tacere 10. Successivamente, molti gruppi usati locus AAVS1 e descritti espressione del transgene stabile in hPSCs indifferenziate, nonché nella loro progenie differenziata di tutti tre strati germinali, sia in vitro che in vivo 2,8,11,12. I recenti risultati comunque nuance questi risultati, come il locus AAVS1 è stato trovato a esercitare l'inibizione transgene variabile in vitro in hESC indifferenziato e in epatociti progenie 13.
Ulteriori studi di screening che utilizzano approcci di integrazione casuali e metodi per determinare l'integrazione copia singola mirato per trovare genositi di integrazione mic resistenti al transgene silenziamento durante l'espansione e la differenziazione hPSCs 14,15. Nel complesso, fino ad ora, nessun sito genomico è stato completamente convalidato come un porto sicuro in hPSCs e la loro progenie; identificazione di un sito appropriato per ubiquitous espressione del transgene stabile, non solo in hPSCs ma anche nelle loro progenie differenziate in vitro e in vivo, rimane da risolvere. Tra tutti i loci studiati e nonostante i suoi limiti, AAVS1 rimane il più caratterizzata e più utilizzato nel campo della ricerca sulle cellule staminali.
RMCE è stato eseguito con successo in hPSCs in alcuni di questi loci 6,7,14,16, utilizzando per lo più Cre ricombinasi, anche se ci sono indicazioni che FLPE è più efficiente di Cre 17. In tutti questi casi, una cassetta resistenza ai farmaci positivo è stato utilizzato per la selezione delle colonie ricombinanti. Anche se di successo, queste procedure non costituiscono un progresso tecnico sopra gene- seriele procedure di modifica utilizzando ZFNs, Talens o CRISPR / Cas9, come una singola procedura di selezione antibiotica non esclude integrazioni casuali e richiede lo screening colonia per identificare cloni correttamente mirati.
In questa procedura, si descrivono metodi per eseguire RMCE in hPSCs nel locus AAVS1 utilizzando una combinazione di positivo (all'interno della cassetta in entrata) e negativo (all'interno della cassetta preintegrate) selezioni che consentono la generazione di linee transgeniche policlonali di ± 15 giorni con 100% di efficienza e privo di eventi di integrazione casuali. Pertanto, questo metodo rappresenta un progresso al di là delle tecnologie RMCE attualmente descritte in hPSCs.
metodi di modifica gene in loci di porto sicuro rimangono uno strumento essenziale per lo sviluppo transgenesi in hPSCs. Anche se il carattere porto sicuro di AAVS1 è recentemente stata messa in discussione per alcune applicazioni 13,18, questo locus rimane attualmente la migliore caratterizzato nelle linee di cellule di derivazione umana. La consapevolezza dei suoi limiti in hPSCs può contribuire ad ottenere dati affidabili. Pertanto, AAVS1 ancora si pensa che essere un sito utile, ad esempio, per gli studi GAIN- e la perdita-di-funzione o espressione inducibile / costitutiva di fattori che richiedono un contesto isogenico all'interno e tra determinati background genetico.
Il locus AAVS1 è stato preso di mira da molti gruppi che utilizzano ZFNs, TALEN o CRISPR / Cas9 1,2,19. Queste nucleasi aumentano significativamente l'efficienza di ricombinazione omologa in un determinato locus. Tuttavia, il processo di schermo e caratterizzare completamente cloni correttamente mirati, gratuitamente integ casualerazione e di mantenere la pluripotenza e genomica integrità può richiedere fino a 3 mesi (utilizzando strumenti di editing gene ottimizzati) (Figura 3). Gli ultimi due possono essere causati da eventuali mutazioni generati dall'attività nucleasi centra la porta. Il sistema RMCE utilizzato qui, tuttavia, offre un metodo rapido, efficiente ed elegante per raggiungere questo obiettivo in sole due settimane, una volta specifici ricombinasi sequenze bersaglio sono preintegrate nel locus AAVS1. Uso di selezione positiva / negativa e un programma di selezione adeguata sono i principali fattori che contribuiscono alla semplificazione del montaggio gene nel locus AAVS1 da RMCE.
caratterizzazione genotipica delle nuove linee transgeniche è notevolmente ridotta (non screening clonale è necessario), e la caratterizzazione associata a centrare la porta nucleasica è reso superfluo a causa della specificità della FLPE per FUz. La caratterizzazione può anche essere ridotto in esperimenti di routine RMCE dimostrando l'completa perdita di espressione GFP dalla linea cellulare master (Figura 2A), in quanto lo scambio cassetta piena e mancanza di integrazione casuale sono già sufficientemente dimostrato mediante PCR (Figura 2B) e Southern blot 13. L'uso della selezione positiva / negativa costituisce anche la principale differenza con le relazioni precedenti. Diversi gruppi che in precedenza descritti RMCE in hPSCs, sia nel AAVS1 o di altri loci, impiegato solo un singolo passo selezione positiva 7,14,16. Ciò non costituisce un importante vantaggio tecnico su editing gene eseguita con nucleasi, perché lo screening colonia deve essere ugualmente eseguita per dimostrare corretta integrazione e assenza di integrazione casuale a livello clonale.
L'uso di questo sistema RMCE in molteplici linee hESC / IPSC richiede preintegrazione del descritto cassette FRT contenenti nel locus AAVS1 di ciascuna linea indipendente. Tuttavia, una volta generate,la sua rapidità e semplicità rende possibile lo sviluppo di semi-high throughput schermi genetiche in impostazioni isogenici definite per le applicazioni di cui sopra, che altrimenti sarebbe tecnicamente molto tempo. Inoltre, tutti i vettori RMCE sono costruiti all'interno PZ AAVS1 vettore gene-targeting utilizzato per indirizzare il locus con ZFNs, ma Talens o CRISPR / Cas9 sono stati segnalati anche. dualità del vettore RMCE è molto utile per generare più righe per un transgene determinato hPSCs con o senza FRT. Ad esempio, un colpo ha dimostrato con successo in uno schermo genetica decisa svolta da RMCE idealmente bisogno di essere testato in più righe HPSC per confermare i risultati. In assenza di diverse linee cellulari maestro RMCE-adatto, gene targeting diretto del colpo con nucleasi potrebbe essere eseguita. L'utilità del duplice carattere dei vettori RMCE è stato dimostrato dal nostro gruppo 20. In questo studio, la correzione genica è stata effettuata in paziente derivateDemenza frontotemporale (FTD) iPSCs che hanno una mutazione che causa progranulin (PGRN) carenza di espressione. Gene complementazione mediante inserimento ZFNs mediata nel locus AAVS1 di una cassetta che ripristinato livelli PGRN, correggere il fenotipo difettoso in corticogenesi associata alla presenza della mutazione. Inoltre, un analogo è stato generato da RMCE in hESC WT per essere usato come controllo per l'espressione PGRN esogena.
In assenza di colonie ricombinanti, controlla l'efficienza di trasfezione del vettore RMCE donatore. efficienze di trasfezione superiori al 30% danno i risultati sopra indicati. Bassa efficienza di trasfezione diminuiscono l'efficienza di ricombinazione. Infine, il sistema RMCE è stato generato nel locus AAVS1, ma è applicabile a qualsiasi altro locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |