Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.
Hatta CRISPR-Cas9, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik modifikasyon liderliğindeki gen hedefleme teknolojileri devrimi ile hala zaman alıcıdır. daha hızlı ve off-hedef etkilerine daha az eğilimli Cre veya FLPe gibi siteye özgü hedefli rekombinaz kullanmak yaklaşımlar, yarar olabilir güvenli liman loci entegre transgenlerin ile rekombinant çizgileri kullanıyoruz karşılaştırmalı çalışmalar. önemli ölçüde daha iyi performans gen çoğu yönden hedeflemeyen, her ne kadar bu tür yöntemler, tarif edilmiştir. Çinko-parmak nükleazlar kullanılması, daha önce heterotypic FRT dizileri ile çevrili kaset ifade eden bir GFP-Higromisin-tk içeren hPSCs arasında AAVS1 odağı bir ana hücre hattını oluşturdu. Burada, bu hattı kullanarak FLPe rekombinaz aracılı kaset değişimi (RMCE) gerçekleştirmek için prosedürler açıklanmaktadır. ana cell hattı yükselticisiz bir puromisin direnç içerir ve FLPe rekombinaz bir RMCE verici vektör ile transfekte edilir. hem (Puromycin) pozitif ve negatif (FIAU) seçim programının uygulama rastgele entegrasyonları olmadan RMCE seçimine yol açar. RMCE% 100 verimle 15 D olarak tam anlamıyla karakterize pluripotent poliklonal transjenik çizgiler oluşturur. Son zamanlarda AAVS1 mahalinin sınırlamaları açıklanan rağmen, sistemin kolaylığı, izogenik ayarları hPSC transgenesis önünü açıyor karşılaştırmalı çalışmalar için gerekli olduğunu ve aksi olur fonksiyon analizi kar / zararı yarı yüksek verimli genetik ekranlar sağlıyor çok zaman alıcı olabilir.
Hedeflenen genom rekombinasyon araştırma birçok alanda hızlı gelişmeler kolaylaştırmıştır. Farelerde, genom düzenleme ve kök hücre araştırmaları arasındaki sinerji gen fonksiyonu ve gen regülasyonu karmaşık mekanizması artan bir anlayış için izin verdi. Uzun yıllar insan embriyonik kök hücreleri ilk izolasyonu (hESC), ve indüklenen sonra insan yana, pluripotent kök hücreleri (hiPSCs), gen düzenleme teknik engel oluşturmuştur, ancak böyle bir ilerleme ve ayrıca insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) beklenen . Hedeflenen nükleazlar-Çinko Parmak Nükleazlar (ZFNs), Transkripsiyon aktivatör gibi efektör nükleazlar (TALEN), ya da kullanarak genom mühendisliği son gelişmeler kümelenmiş düzenli palindromik tekrarlar / CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR / Cas9) bize bu üstesinden gelmek için izin kısa interspaced 3 – zorluklar, etkin sürecini rekombinasyon 1 hedeflenen yapmada.
m spesifik lokusRosa26, Hprt1 veya COL1A1 gibi yan etkiler olmadan daha güvenilir ve her yerde transgen ekspresyonunu sağlar ouse genomu, genetik çalışmalar, performansında önemli bir araç haline gelmiştir. Güvenli liman lokusları izogenik bağlamlarda farelerin farklı çizgileri arasındaki karşılaştırılabilir analiz sağlar. Bu sokma mutajenez, doza bağlı etkileri veya alacalı transgen ekspresyonu gibi iyi bilinen sınırlamalar ile ilişkili standart rasgele entegrasyon yöntemleri kullanılarak elde edilemez. güvenli liman loci Gen düzenleme kolaylığı ve esneklik özellikle (sırasıyla, loxP veya FRT) hedef dizileri tanıyan ve aynı hedefler arasında etkili rekombinasyon katalize Cre veya Flippase (FLPe) gibi alana özgü hedefli rekombinaz kullanımı yoluyla artar. Bu özelliklerinden dolayı, önceden hazırlanmış güvenli liman loci içinde loxP veya FRT dizileri kullanılarak rekombinaz-aracılı gen düzenleme trans fare kullanılan yaygın bir araçtırdoğuşu. Kaset yerleştirilmesi veya özdeş hedef diziler arasındaki aracılı eksizyonunu ek olarak, uyumlu loxP ya FRT sitelerinin kullanılması yeniden bağlayıcının aracı olduğu kaseti değişimi (RMCE) 4 sağlar.
İnsanda, güvenli liman loci yapılmıştır tanımlamaya çalışır. Fare orthologous HPRT, kayıp fonksiyon-Lesch-Nyhan Sendromu ve ROSA26 ile ilişkisi olmasına rağmen hPSCs hedef edilmiştir. HPRT hızla ROSA26 gibi, ESC transgen ifade susturmak ve rapor edilmiştir, transgen ekspresyonunu sürdürme yeteneği 7 – terminal açıdan farklılaşmış hücreleri, 5 araştırılmamıştır. CCR5 geninin homozigot boş mutasyon iyi insanlarda tolere gibi görünüyor, çünkü güvenli liman olarak değer. Değerlendirildi CCR5 hedeflenen ve EKH 8,9 dahil olmak üzere farklı insan hücre hatlarında, istikrarlı transgen ekspresyonunu sürdürmek bildirildi. Ancak,İkincisi, uzun vadeli kültür sırasında klonal düzeyde kanıtlanmış değildi ve her yerde transgen ifadesi üç germ farklılaşmış döl gösterdi değildi. AAVS1, Adeno ilişkili Virüs tip 2 (AAV) doğal entegrasyon sitesi, test edildi transgen nedeniyle rapor direnç yanı sıra hESC, içinde 10 susturulması. Daha sonra, birçok grup, in vitro ve in vivo 2,8,11,12, hem AAVS1 lokusunu kullanılan farklılaşmamış hPSCs sabit transgen ekspresyonunu, ve her üç germ farklılaşmış döl tarif. AAVS1 lokusu farklılaşmamış hESC ve hepatosit döl 13 in vitro değişken transgen inhibisyonunu uygulamak için bulunmuştur olarak son sonuçlar Bununla birlikte, bu bulgular nüans.
rasgele entegrasyon yaklaşımları ve yöntemleri kullanarak ilave tarama çalışmaları Geno bulmak amaçlanmıştır tek kopya entegrasyon belirlemek içinhPSCs genişleme ve farklılaşma 14,15 sırasında transgen susturulması dayanıklı mikrofon entegrasyon siteleri. Genel olarak, şimdiye kadar, hiçbir genomik site tam hPSCs ve döl güvenli bir liman olarak onaylanmıştır; her yerde sabit bir transgen ekspresyonu, hPSCs değil, aynı zamanda in vitro ve in vivo olarak farklılaşmış progeny'lerinde sadece uygun bir site tanımlanması, çözülmesi gerekmektedir. Tüm çalışılan loci arasında ve sınırlamalara rağmen, AAVS1 kalır en iyi karakterize ve kök hücre araştırmalarında en çok kullanılan.
RMCE başarıyla FLPe Cre 17 daha etkilidir endikasyonlar olsa bile, çok Cre rekombinaz kullanılarak, bu lokuslarının 6,7,14,16 bazı hPSCs içinde gerçekleştirilmiştir. Bütün bu durumlarda, bir pozitif ilaç direnci kaseti, yeniden kolonilerin seçimi için kullanılmıştır. Başarılı olsa da, bu işlemler standart gen üzerinde bir teknik ilerlemeyi teşkil etmemektedirZFNs kullanarak düzenleme işlemleri, Talens veya CRISPR / Cas9, gibi tek bir antibiyotik seçimi prosedürü rasgele entegrasyonları ekarte ve doğru hedef klonları tanımlamak için koloni taraması gerektiriyor.
Bu prosedürde, metotlar ile ± 15 gün içinde (önceden hazırlanmış kaset içinde) poliklonal transgenik hatların üretilmesine izin seçimleri, bir (gelen kaset içinde) pozitif kombinasyonunu ve negatif kullanılarak AAVS1 lokusunda hPSCs olarak RMCE gerçekleştirmek için tarif % 100 verim ve rasgele entegrasyon olaylarının ücretsiz. Bu nedenle, bu yöntem hPSCs şu anda açıklanan RMCE teknolojileri ötesinde ilerlemeyi temsil ediyor.
güvenli liman loci Gen düzenleme yöntemleri hPSCs içinde transgenesis geliştirmek için çok önemli bir araçtır kalır. AAVS1 güvenli bir liman karakteri son zamanlarda bazı uygulamalarda 13,18 sorgulanmıştır rağmen, bu lokus şu anda en iyi insandan türetilmiş hücre soylarında, özelliği kalır. hPSCs kendi sınırlamaları Farkındalık güvenilir veri elde etmek için yardımcı olabilir. Bu nedenle, AAVS1 de gain- ve zarar-fonksiyon çalışmaları veya içinde ve kararlı bir genetik arka arasında bir izogenik bağlam gerektirir faktörlerin uyarılabilir / konstitütif ekspresyon için, örneğin, yararlı bir site olduğu tahmin edilmektedir.
AAVS1 odağı ZFNs, Talen veya CRISPR / Cas9 1,2,19 kullanarak birçok grup tarafından hedef olmuştur. Bu nükleazlar önemli ölçüde belirli bir lokusunda homolog rekombinasyon etkinliğini artırmaktadır. Ancak süreç ekrana ve tam rastgele INTEG serbest doğru hedeflenen klonlar, karakterizerasyon ve pluripotensini korumak ve (optimize gen düzenleme araçlarını kullanarak) 3 ay (Şekil 3) kadar sürebilir bütünlüğünü genom. Son iki hedef dışı nükleaz aktivitesi ile üretilen mümkün mutasyonlar neden olabilir. Burada kullanılan RMCE sistemi, ancak, rekombinaz spesifik hedef diziler AAVS1 lokusuna önceden hazırlanmış bir kez, iki hafta içinde bu amaca ulaşmak için, hızlı, verimli ve zarif bir yöntem sunmaktadır. Pozitif / negatif seleksiyon ve uygun bir seçim programının kullanımı RMCE tarafından AAVS1 lokusunda gen düzenleme basitleştirilmesi katkıda bulunan ana faktörlerdir.
Yeni transgenik hatların Genotipik karakterizasyonu anlamlı (hayır klonal tarama gerekli) azalır ve hedef dışı nükleaz aktivitesi ile ilişkili karakterizasyonu nedeniyle FRTS için FLPe özgüllüğüne vazgeçilebilir hale getirilir. karakterizasyonu da göstererek, rutin RMCE deneylerinde azaltılabilirTam kaseti değişimi ve rasgele entegrasyon eksikliği ile yeterli PCR (Şekil 2B) ile gösterilmiştir, çünkü ana hücre hattı (Şekil 2A) GFP ekspresyonu tamamen kaybedilmesi ve Southern blot 13. pozitif / negatif seleksiyon kullanımı da önceki raporlar ile temel fark oluşturmaktadır. Daha önce AAVS1 veya diğer lokusundakı ya hPSCs bölgesindeki RMCE açıklanan çeşitli gruplar, tek bir pozitif seçim adımı 7,14,16 kullanılabilir. koloni taraması eşit klonal düzeyde doğru entegrasyon ve rasgele entegrasyon yokluğunu göstermek amacıyla yapılmalıdır, çünkü bu, nükleazlara ile yapılan gen düzenleme üzerinde önemli bir teknik avantaj teşkil etmez.
Birden HESC / iPSC satırlarında RMCE sisteminin kullanımı her bir bağımsız hattının AAVS1 lokusunda tarif FRT içeren kasetin preintegration gerektirir. Bununla birlikte, bir kez oluşturulanonun hız ve basitlik mümkün teknik olarak çok zaman alıcı olacaktır aksi takdirde yukarıda belirtilen uygulamalar için tanımlanan izogenik ayarlarında yarı yüksek verimlilik genetik ekranlar geliştirmek için yapar. Buna ek olarak, tüm RMCE vektörleri ZFNs ile lokusunu hedeflemek için kullanılabilir pZ AAVS1 gen hedefleme vektörü içinde inşa edilmiştir, ancak TALENS veya CRISPR / Cas9 da bildirilmiştir. RMCE Vector ikilik veya FRT olmayan hPSCs bir kararlı transgen için birden fazla satır üretmek için son derece yararlıdır. Örneğin, tek bir vuruş ideal sonuçları doğrulamak için birden çok hPSC hatları test edilmesi gerekir RMCE tarafından gerçekleştirilen belirli bir genetik ekran başarılı gösterdi. Birden RMCE-müsait ana hücre hatlarının yokluğunda, nükleazlar kullanılması isabet hedefleme doğrudan gen gerçekleştirilebilir. RMCE vektörleri ikili karakteri yarar Grubumuzun 20 tarafından kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, gen rötuşu hastanın türevi içinde gerçekleştirilmiştirFrontotemporal Demans (FTD) PROGRANULIN (PGRN) ifade eksikliği yol açan bir mutasyon taşıyan iPSCs. PGRN seviyeleri restore eden bir kaset bölgesinin AAVS1 lokusunda ZFNs aracılı sokulması ile gen tamamlama, mutasyon varlığı ile ilişkili kortikogenezin kusurlu fenotipi giderilmiştir. Buna ek olarak, benzer bir dizisi, eksojen PGRN ifadesi için bir kontrol olarak kullanılmak üzere WT hESC RMCE göre oluşturuldu.
Rekombinant kolonilerin yokluğunda, RMCE verici vektör transfeksiyon kontrol edilmesi. % 30 daha üstün transfeksiyon verimliliği yukarıda belirtilen sonuçlar. Alt transfeksiyon verimliliği rekombinasyon verimliliği azaltmaktadır. Son olarak, RMCE sistemi AAVS1 lokusunda elde edilmiş, fakat herhangi bir başka mahale uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |