Скрининг на эндокринную активность в воде с использованием коммерчески доступного<em> In Vitro</em> Трансактивационную Биотесты
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
В пробирке трансактивации биопроб показали обещание в качестве инструментов мониторинга качества воды, однако их принятие и широкое применение было затруднено отчасти из – за отсутствия стандартизированных методов и наличия надежной, удобной технологии. В этом исследовании, имеющиеся в продаже, подразделение арестованы клеточные линии были использованы для количественного скрининга эндокринной активности химических веществ, присутствующих в пробах воды, представляющих интерес для профессионалов качества окружающей среды. Единый, стандартизированный протокол, который включал гарантии всеобъемлющего качества / контроля качества (QA / QC) проверяет, был разработан для активности Эстроген и глюкокортикоидных рецепторов (ER и ГР, соответственно) с использованием клеток на основе флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) анализа. Образцы очищенных коммунально-бытовых сточных вод стоков и поверхностных вод из пресноводных систем в Калифорнии (США), были извлечены с использованием экстракции твердой фазы и анализировали на эндокринную активность с использованием стандартизированного протоцвет Предпосылки и доза-реакция для конечных конкретных эталонных химических веществ встретились руководящие принципы ОК / КК считаются необходимыми для надежного измерения. Реакция биопроба скрининг проб поверхностных вод был в значительной степени не обнаруживается. В отличие от стоков пробы из вторичных очистных сооружений имели самую высокую активность измеримое, с оцениваемыми биопроб эквивалентных концентрациях (BEQs) до 392 нг / л дексаметазон для GR и 17 нг 17β-эстрадиол / L для ER. Ответ на количественное определение биологической активности третичного отходящем образца была ниже, чем измеренная для вторичных стоках, что указывает на меньшую остаточную эндокринных активных химических веществ, после того, как доочистку. Этот протокол показал , что в пробирке трансактивации биопроб , которые используют коммерчески доступный, разделением задержан клетка "наборы", могут быть приспособлены для скрининга на эндокринную активность в воде.
Introduction
Текущий контроль за качеством воды основывается на способности точно и точно измерить возникновение химических загрязнителей в качестве прокси для воздействия на диких животных и людей. Тем не менее, это химическое вещество, по-химического мониторинга и оценки парадигма не может идти в ногу с постоянно меняющейся химической вселенной, что мы сталкиваемся. Чем больше мы узнаем о судьбе и воздействии синтетических и природных химических веществ, мы продолжаем искать средства измерения, которые касаются ожидаемых биологических воздействий, и что в то же время имеют иммунитет к изменениям в химическом производстве, эксплуатации и окружающей среды ввода. Такие инструменты особенно важны для понимания того, неизвестные или новые химические вещества и продукты преобразования, заслуживают нашего внимания. Кроме того, сложные смеси химических веществ, присутствующих в воде плохо решаются в рамках отдельных химического мониторинга. Таким образом, перед нами стоит задача модернизации существующего инструментария мониторинга для более эффективного решения этих проблем в поверхностных водах тхат получают сброс очищенных сточных вод сточных вод и городского / ливневых стоков.
В последние годы Биоаналитическая методы показали обещание как скрининг инструменты для оценки качества воды. В частности, in'vitro биопроб , которые реагируют на химические вещества , действующие с помощью известно, конкретные способы действия 1,2 представляют большой интерес для мониторинга окружающей среды сообщества 3. Многочисленные исследования использовали в пробирке биопроб для количественного определения эндокринную активность питьевой, поверхностных и сточных водах 4 -6. Кроме того, ряд биопробы целевых молекулярных исходных событий (например, активация рецептора) , которые потенциально могут быть связаны с пагубными последствиями через неблагоприятный исход пути анализа 7,8.
Эволюция биологического скрининга для оценки качества воды было относительно быстрым, с сотнями различных в пробирке биопроб конечных точек будучи оценены по ихУтилита 9,10. В настоящее время лишь несколько биопробы было показано , для достижения хорошей точности измерений ( в пределах лаборатории), демонстрируя при этом способность различать среди водных качеств 5,6. Для получения очищенных сточных вод сточных вод , в частности, возникновение эстрогенов и глюкокортикоидных стероидов было успешно учитываются с использованием в пробирке трансактивации 11,12. Тем не менее, большинство исследований на сегодняшний день использовали биопробы, чьи клеточные линии, являются собственностью компании (и, следовательно, не получили широкого распространения), требуют постоянного ухода и манипуляции, или обоих. В результате, возможность стандартизации протоколов, выполнять межлабораторных калиброванию, и в конечном итоге передать эту технологию скрининга в водных ресурсах сообщества по-прежнему затруднены.
По крайней мере один поставщик биопроб в пробирке , прошедших проверку в рамках программы США ToxCast является коммерчески доступным 13 в простой в использовании "замораживании и оттаивании4; форматов. Эти разделением арестованы клетка "наборы" , как было показано , чтобы быть надежными в измерении активности химических веществ , извлеченных из воды , представляющих различные уровни обработки 14. Хотя протоколы поставщика доступны для скрининга биоактивности отдельных химических веществ или смесей, некоторые из них требуют доработки, прежде чем они могут быть применены к проб воды. Очищенные сточные воды сточные 15, ливневые стоки 16, получая воды 17,18 и совсем недавно оборотной воды 19,20 являются главными примерами водных сред, представляющих интерес для сообщества качества воды.
Данное исследование представляет собой единый, стандартизированный протокол для измерения эндокринную активность в пробах воды с использованием коммерчески доступного, разделением арестован в пробирке трансактивации биопробы. Мы продемонстрировали надежность протокола посредством комплексной оценки фона, дозы и чувствительностью повторяемости ответа на ТВтO конечные точки, представляющие особый интерес к эстрогенам и глюкокортикоидных рецепторов трансактивацией (ER и ГР, соответственно). Протокол был применен к образцам экрана очищенных сточных вод стоков и поверхностных вод из пресноводных систем в Калифорнии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо документированы активность экологических эстрогенов, таких как эстрадиол-17 & beta ; (E2) гарантирует скрининг для этих химических веществ в концентрациях нг / л 23,24. В данном исследовании реакция ER для очистки сточных вод стоков (диапазон BEQ: от 2,3 до 17 нг E2 / л) была несколько вы?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
