Un modelo de abrazadera hiliar hígado de rata única fue desarrollado para estudiar el impacto de moléculas farmacológicas en la mejora de la lesión por isquemia-reperfusión. Este modelo incluye la canulación directa del suministro de portal al segmento de hígado isquémico a través de una rama de la vena porta, lo que permite la entrega hepática directa.
cirugía hepática Major con oclusión de entrada, y el trasplante de hígado, requieren un período de isquemia caliente, y un periodo de reperfusión conduce a la isquemia / reperfusión (I / R) lesión con consecuencias negativas innumerables. lesión I / R potencial en órganos marginales destinados a trasplante de hígado contribuye a la escasez de donantes de corriente secundaria a una tasa de utilización de órganos disminuido. Existe una necesidad significativa para explorar lesión hepática de I / R con el fin de mediar en su impacto en la función del injerto en el trasplante. modelos de abrazadera hiliares de hígado de rata se utilizan para investigar el impacto de diferentes moléculas en la lesión I / R hepática. Dependiendo del modelo, estas moléculas han sido entregados de usar la inhalación, la infusión epidural, inyección intraperitoneal, la administración intravenosa o la inyección en la vena mesentérica superior periférica. Un modelo de abrazadera hiliar hígado de rata se ha desarrollado para su uso en el estudio del impacto de las moléculas farmacológicas en la mejora de I / R lesión. el describmodelo ed para la abrazadera hiliar hígado de rata incluye la canulación directa del suministro de portal al segmento hepática isquémica a través de una rama lateral de la vena porta, lo que permite la entrega hepática segmentaria directa. Nuestro enfoque es inducir isquemia en los lóbulos laterales y la mediana se dejaron durante 60 min, tiempo durante el cual se infunde la sustancia en estudio. En este caso, pegilado-superóxido dismutasa (PEG-SOD), un eliminador de radicales libres, se infunde directamente en el segmento isquémico. Esta serie de experimentos demuestra que la infusión de PEG-SOD es protectora contra la lesión I / R hepática. Las ventajas de este enfoque incluyen la inyección directa de la molécula en el segmento isquémica con la consiguiente disminución en el volumen de distribución y reducción de los efectos secundarios sistémicos.
Cirugía hepática Major con oclusión de entrada, y el trasplante de hígado, requieren un período de isquemia caliente, y un periodo de reperfusión conduce a la isquemia / reperfusión (I / R) lesión 1. Las consecuencias de la lesión I / R en el hígado se han detallado ampliamente 1, 2, 3. Consecuencias de la lesión I / R se detalla en la literatura incluyen: generación de especies reactivas de oxígeno, la iniciación de la cascada inflamatoria, incluyendo la activación de los neutrófilos, las células de Kupffer, y células endoteliales, la activación del sistema de hemo oxigenasa y la activación de receptores de tipo Toll, una desequilibrio entre la endotelina y el óxido nítrico, la activación del factor nuclear-kB, y la promoción de citocinas proinflamatorias y la síntesis de 1, 2, 3 molécula de adhesión. Estos eventos proinflamatorias puede lead a la apoptosis, necrosis, la disfunción de órganos y la insuficiencia de órganos eventual 3.
I / R lesión de órganos destinados a trasplante de hígado puede conducir a la pérdida del injerto temprano y contribuye a la escasez de donantes actual como órganos marginales son más susceptibles a las lesiones 3. Actualmente hay 15.226 beneficiarios potenciales en la lista de espera para un trasplante de hígado en los Estados Unidos y 4 sólo 5.950 trasplantes de hígado se realizaron en 2015 5. Debido a esta limitación extrema en la disponibilidad de órganos, la investigación a explorar se necesita lesión I / R hepática con el fin de optimizar la función del injerto y la utilización de órganos.
Los modelos animales utilizados para estudiar la lesión hepática I / R incluyen rata modelos de abrazadera hiliar y modelos de trasplante de hígado de rata. Hay una variedad de modelos de abrazadera hiliares rata actualmente en uso. El más común es aquella en la que la vena portal, arteria hepática y biliar duct suministro de los lóbulos laterales y la mediana de la izquierda se sujetan utilizando clips de microcirugía 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 durante 30 a 60 min 6, 7, 10, 13, 14, y después de un periodo de reperfusión de 60 min a 24 h 7, 9, 10, 13, se permite 14. Los lóbulos laterales y la mediana izquierdo del hígado de rata comprenden de aproximadamente 70% del parénquima hepático 9. Algunos protocolos diseñados para estudiar el precondicionamiento isquémico incluyen sujeción intermitente de los vasos hiliareso el de las extremidades posteriores antes de un período más largo de la isquemia inducida por apriete los vasos hiliares 9, 13. Hay también varias modificaciones descritas en la literatura. La primera es para sujetar la vena porta y arteria hepática suministro de los lóbulos laterales y la mediana izquierda, pero excluir el conducto biliar 15. Una segunda modificación es el de inducir isquemia hepática total de por apriete del conducto vena portal, arteria hepática y biliar antes de su división 16, 17, 18, 19, 20. Una tercera modificación incluye la sujeción de los vasos hiliares al lóbulo derecho durante 30 a 60 min 8. Una modificación adicional implica la sujeción del haz vascular en una extremidad posterior con el fin de inducir lesiones en el hígado 13, 21 </sup>. Varios enfoques para el procedimiento abrazadera hiliares se ilustran en la Figura 1A-D.
modelos de abrazadera hiliares de hígado de rata se han utilizado para estudiar el impacto de diferentes moléculas y compuestos en hepática de I / R. Dependiendo del modelo utilizado estas moléculas han sido entregados usar la inhalación de 11, la infusión epidural 12, la inyección intraperitoneal 17, 18, 21, 22, la administración intravenosa 10, 14, 15, 19, 23, 24 o inyección en la vena periférica mesentérica superior 8 .
El modelo para la abrazadera hiliar hígado de rata se detalla en este informe includit canulación directa del suministro de portal al segmento isquémico a través de una rama lateral de la vena porta (Figura 2), lo que permite segmental directa entrega hepática de la sustancia farmacológica en estudio. Nuestro enfoque es inducir isquemia en los lóbulos laterales y la mediana se dejaron durante 60 min, tiempo durante el cual una infusión de la sustancia en estudio, en este caso, la superóxido pegilado-dismutasa, un eliminador de radicales libres 25, se infunde directamente en el segmento isquémico . Las muestras de sangre se toman antes de la inducción de la isquemia y a 120 minutos después de la reperfusión. En este punto, la rata se sacrifica y se toman muestras de los lóbulos izquierdo y la mediana. Adicionalmente, se toman muestras del lóbulo derecho de servir como un control interno.
Hay numerosas ventajas de este enfoque. Primero y ante todo, cuando la sustancia farmacológica en estudio puede ser inyectado directamente en el segmento isquémico el volumen odistribución f es bastante bajo en comparación con el volumen de distribución de la inyección en la circulación sistémica o la cavidad peritoneal. Además, este enfoque reduce, aunque no elimina, la posibilidad de efectos secundarios sistémicos.
Esta serie de experimentos demostró que la inyección de PEG-SOD en la izquierda y los lóbulos mediana conducido a disminuciones significativas en la liberación de ALT, la peroxidación lipídica de las membranas celulares (MDA), y el mantenimiento de glutatión (GSH) en comparación con los controles (solución salina normal ). transaminasas tejido del hígado incluyendo Alanina aminotransferasa (ALT) son marcadores de lesión hepatocelular establecidos. La disminución de ALT cuando el lóbulo izquierdo se inyecta con PEG-SOD sugiere un efecto protector de PEG-SOD. El aumento de tejido MDA indica aumento de la peroxidación de lípidos y se considera un marcador de estrés oxidativo y lesión tisular. La sobreproducción de especies reactivas de oxígeno provoca un aumento en la producción de MDA 26. La reducción significativa en el tejido MDA en los lóbulos izquierdo y la mediana del animal cuando se inyecta con PEG-SOD demuestra un efecto protector de PEG-SOD. Esto es consistente con el conocimiento actual que PEG-SOD protege las células del dañocausada por parcialmente reducidos especies reactivas de oxígeno 27. Adicionalmente, en la presencia de especies reactivas de oxígeno, disulfuro de glutatión se reduce a glutatión (GSH) 28. El mantenimiento en GSH en los lóbulos izquierdo y la mediana del hígado inyectado con PEG-SOD refuerza aún más el efecto protector de PEG-SOD. Además se demuestra que hay un aumento de exfoliados caspasa-3, un producto de la apoptosis, en el tejido expuesto a la lesión por isquemia-reperfusión. La disminución de la caspasa-3 escinde en el lóbulo izquierdo cuando son tratados con PEG-SOD sugiere que PEG-SOD conduce a una disminución en la apoptosis.
La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima crítica en la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno. La enzima cataliza la conversión de dos aniones superóxido en peróxido de hidrógeno y agua. La enzima catalasa luego convierte peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, completando el proceso 25. La vida media deSOD nativa limitado su uso en modelos experimentales hasta el desarrollo de polietileno superóxido conjugado glicol-dismutasa (PEG-SOD). Conjugación de SOD a polietilenglicol aumenta su vida media de 6 min a 14 h. Nguyen et al. demostrado su capacidad para mitigar la peroxidación de lípidos en la isquemia hepática en un modelo de rata, usando administración sistémica 29.
Hay una variedad de posibles modificaciones de la técnica se detallan aquí y algunos se han descrito previamente en la literatura. Dependiendo de las moléculas modelo utilizado han sido entregados usar la inhalación de 11, la infusión epidural 12, la inyección intraperitoneal 17, 18, 21, 22, la administración intravenosa 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 o inyección en la vena mesentérica superior periférica 8.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. El más importante es la canulación de la vena porta. Se debe tener cuidado de que el agujero cortado en la vena no es demasiado grande. El tejido es muy elástica y el agujero se agrandará por su propia cuenta. Se recomienda comenzar cortando un agujero que es de 0,5 mm con las tijeras de microcirugía. La cánula puede ser alimentado a través del orificio utilizando un instrumento, que permite una mayor agilidad que si intentar realizar esta parte del procedimiento mediante la mano. Además, aunque inicialmente la alimentación de la cánula, debe ser dirigida directamente hacia la bifurcación de las venas porta izquierda y derecha para evitar hacer un agujero a través de la pared posterior de la vena. Cuando la punta de la cánula llega a la bifurcación, puede entonces ser alimentada en la vena izquierda específicaaliado. Una vez que la cánula se introduce en la vena porta izquierda, que abastece tanto a la izquierda y la mediana de lóbulos, su posición se puede confirmar manualmente por sentirlo dentro de la vena. Su posición también puede ser confirmada mediante la inyección de una pequeña cantidad de solución salina fría y ver el efecto de blanqueado en los segmentos suministrados del hígado.
El modelo de abrazadera hiliar hígado en la rata proporciona una plataforma reproducible y estable para la demostración de la lesión isquémica-reperfusión hepática. Modelos de abrazadera hiliares variables se han utilizado por los investigadores para estudiar los efectos protectores de anti-oxidantes y otras moléculas pequeñas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Puntos de variación incluyen la que los vasos son abrazadera ed, que segmentos se efectúan isquémico, sea o no el conducto biliar está incluido y la longitud del periodo de reperfusión 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Además, cuando este modelo se utiliza para estudiar el impacto de la administración de una molécula de la ruta de administración también es heterogénea 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Hay varias ventajas para el enfoque descrito. En primer lugar, la canulación directa del suministro de portal al segmento isquémico permite segmental entrega hepática directa de la sustancia farmacológica en estudio. Esto permite la utilización de los otros lóbulos de los hígados como un control interno. en segundo lugar, la canulación hepática segmentaria permite un volumen reducido de distribución de la molécula en estudio. Este enfoque reduce así el riesgo de efectos secundarios sistémicos como la sustancia se inyecta directamente en el segmento de hígado de interés. canulación directa del segmento hepática permite la sustancia a suministrar pre-isquemia, Intra-isquemia o post-isquemia. Esto permite que para el estudio del efecto de la molécula en cualquier punto en el ciclo de la lesión por isquemia-reperfusión. Con el aumento de la longitud de tiempo de isquemia y el aumento de nivel de la lesión oportunidad adicional para estudiar la regeneración del hígado estaría disponible.
También hay algunas limitaciones de este enfoque. El primero es el costo de puesta en marcha. La compra de un microscopio quirúrgico podría ser un costo significativo de puesta en marcha de un laboratorio que no posea ya una. Esta técnica puede ser difícil o imposible sin un microscopio. El segundo tiempo está aprendiendo curva. Aunque este procedimiento es relativamente simple que requiere un poco de práctica y es probable que un novato requerirá un número significativo de procedimientos para convertirse en un experto.
En resumen, este modelo permite una plataforma reproducible, sencillo y rentable para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión hepática. Aunque en el protocolo descrito aquí gl polietilenosuperóxido ycol-dismutasa, un eliminador de radicales libres 25, se infundió, este modelo podría ser utilizado para infundir una variedad de diferentes sustancias farmacológicas con el fin de evaluar su impacto en I / R lesión en el hígado.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer Dennis Mathias por su trabajo ilustrativo. Este trabajo fue apoyado por el NIH T32AI 106704-01A1 y el Fondo T. Flesch para el trasplante de órganos, la perfusión, Ingeniería y Regeneración de la Universidad Estatal de Ohio.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |