Um modelo de braçadeira hilar fígado de rato original foi desenvolvido para estudar o impacto das moléculas farmacológicas no melhoramento da lesão por isquemia-reperfusão. Este modelo inclui canulação direta da oferta de portal para o segmento fígado isquêmico através de um ramo da veia portal, permitindo a entrega hepática direta.
cirurgia major hepática com oclusão influxo, e o transplante de fígado, necessitam de um período de isquemia quente, e um período de reperfusão que conduz à lesão com consequências negativas miríade de isquemia / reperfusão (I / R). lesão potencial de I / R em órgãos marginais destinados a transplante de fígado contribui para a falta de doadores corrente secundária a uma taxa de utilização órgão diminuído. Existe uma necessidade significativa para explorar hepática lesão de I / R, a fim de mediar o seu impacto na função do enxerto em transplante. De fígado de rato modelos braçadeira hilares são usados para investigar o impacto de diferentes moléculas na lesão de I / R hepática. Dependendo do modelo, estas moléculas foram entregues usando inalação, a infusão epidural, injecção intraperitoneal, administração intravenosa ou injecção na veia mesentérica superior periférica. Um modelo hilar braçadeira de fígado de rato foi desenvolvido para uso em estudar o impacto das moléculas farmacológicas em melhorar lesão de I / R. o described modelo para a braçadeira hilar fígado de rato inclui a canulação directa do fornecimento portal para o segmento hepática isquémica através de um ramal lateral da veia porta, permitindo a entrega hepática segmentar directa. A nossa abordagem é para induzir isquemia nos lóbulos laterais e medianas esquerda durante 60 min, tempo durante o qual a substância em estudo é infundida. Neste caso, peguilado-superóxido dismutase (SOD-PEG), um captador de radicais livres, é infundido directamente no segmento isquémica. Esta série de experiências demonstram que a infusão de PEG-SOD é protectora contra a lesão de I / R hepática. As vantagens desta abordagem incluem a injecção directa da molécula no segmento isquémico, com a consequente diminuição do volume de distribuição e redução em efeitos secundários sistémicos.
Cirurgia major hepática com oclusão influxo, e o transplante de fígado, necessitam de um período de isquemia quente, e um período de reperfusão que conduz à lesão um isquemia / reperfusão (I / R). As consequências do dano de I / R em fígado foram detalhados extensivamente 1, 2, 3. Consequências da I / lesão R descritos na literatura incluem: geração de espécies reactivas de oxigénio, a iniciação da cascata inflamatória, incluindo a activação de neutrófilos, células de Kupffer e células endoteliais, a activação do sistema de heme-oxigenase e a activação dos receptores do tipo Toll, uma desequilíbrio entre endotelina e óxido nítrico, a activação do factor nuclear-kB, e promoção da citocina pró-inflamatória e síntese 1, 2, 3 molécula de adesão. Estes eventos pró-inflamatórios may lead a apoptose, necrose, disfunção de órgãos e eventual falha do órgão 3.
I / R lesão em órgãos destinados a transplantação do fígado pode levar à perda precoce do enxerto e contribui para a falta de doadores corrente como órgãos marginais são mais susceptíveis a lesão 3. Atualmente 15,226 potenciais destinatários na lista de espera para transplante de fígado nos Estados Unidos 4 e apenas 5.950 transplantes de fígado foram realizados em 2015 5. Devido a esta limitação extrema na disponibilidade de órgãos, pesquisa a explorar lesão de I / R hepática é necessária a fim de optimizar o funcionamento do enxerto e a utilização de órgãos.
Os modelos animais utilizados para estudar a lesão hepática I / R incluem modelos de rato hilar braçadeira e modelos de transplante de fígado de rato. Há uma variedade de modelos de fixação hilares rato atualmente em uso. O mais comum é aquele em que a veia porta, artéria hepática e bile duct fornecendo os lóbulos laterais e mediano esquerdo são presos usando grampos de microcirurgia 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, durante 30 a 60 minutos, 6, 7, 10, 13, 14, e em seguida um período de reperfusão de 60 min a 24 h, 7, 9, 10, 13, 14 é permitido. Os lóbulos laterais e medianas esquerdo do fígado de rato compreendem cerca de 70% do parênquima hepático 9. Alguns protocolos concebidos para estudar o pré-condicionamento isquémico incluem aperto intermitente dos vasos hilaresou a corça-membro antes de um longo período de isquémia induzida por aperto dos vasos hilares 9, 13. Existem também várias modificações descritas na literatura. O primeiro é para prender a veia porta e artéria hepática fornecendo os lobos lateral esquerdo e mediano, mas excluem o ducto biliar 15. Uma segunda modificação é para induzir isquemia hepática total por aperto a conduta da veia porta, artéria hepática e biliar, antes da sua divisão 16, 17, 18, 19, 20. Uma terceira modificação inclui aperto dos vasos hilares para o lóbulo direito durante 30 a 60 min 8. Uma modificação adicional envolve o aperto feixe vascular em um membro traseiro, a fim de induzir a lesão no fígado 13, 21 </sup>. Várias abordagens para o procedimento de braçadeira hilar são ilustrados na Figura 1A-D.
De fígado de rato modelos braçadeira hilares têm sido utilizados para estudar o impacto de diferentes moléculas e compostos em hepática de I / R. Dependendo do modelo utilizado estas moléculas tenham sido entregues usando inalação 11, a infusão epidural 12, injecção intraperitoneal 17, 18, 21, 22, a administração intravenosa 10, 14, 15, 19, 23, 24 ou injecção no mesentérica superior periférica da veia 8 .
O modelo de fígado de rato braçadeira hilar detalhado neste relatório inclues canulação directa do fornecimento portal para o segmento isquémica através de um ramal lateral da veia porta (Figura 2), que permite a entrega directa segmentar hepática da substância farmacológica em estudo. A nossa abordagem é para induzir isquemia nos lóbulos laterais e medianas esquerda durante 60 min, tempo durante o qual uma infusão da substância em estudo, neste caso, a superóxido peguilado-dismutase, um captador de radicais livres 25, é infundido directamente no segmento isquémica . As amostras de sangue são tomadas antes da indução da isquemia e a 120 minutos após a reperfusão. Neste ponto, o rato é sacrificado e as amostras são colhidas dos lobos esquerdo e medianos. Além disso, as amostras são colhidas a partir do lobo direito para servir como um controlo interno.
Existem inúmeras vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar e acima de tudo, quando a substância farmacológica sob estudo pode ser directamente injectado no segmento isquémico o volume ódistribuição f é bastante baixa em comparação com o volume de distribuição da injecção na circulação sistémica ou na cavidade peritoneal. Além disso, esta abordagem reduz, embora não elimina, a possibilidade de efeitos colaterais sistêmicos.
Esta série de experiências demonstraram que a injecção de PEG-SOD para a esquerda e lóbulos medianos conduziram a decréscimos significativos na libertação de ALT, a peroxidação lipídica das membranas celulares (MDA), e manutenção de glutationa (GSH), quando comparado com os controlos (solução salina normal ). Transaminases hepáticas tecido incluindo alanina aminotransferase (ALT) são marcadores de lesão hepatocelular estabelecida. A diminuição na ALT quando o lobo esquerdo é injectado com PEG-SOD sugere um efeito protector do PEG-SOD. tecido aumentou MDA indica aumento da peroxidação de lípidos e é considerado um marcador de estresse oxidativo e lesão de tecidos. A superprodução de espécies reactivas de oxigénio provoca um aumento da produção de MDA de 26. A redução significativa no tecido MDA nos lobos esquerdo e médio do animal quando injectados com PEG-SOD demonstra um efeito protector do PEG-SOD. Isto é consistente com o entendimento atual que PEG-SOD protege as células dos danoscausada por espécies reactivas de oxigénio parcialmente reduzido 27. Além disso, na presença de espécies de oxigénio reactivas, dissulfureto de glutationa reduzida é a glutationa (GSH) 28. A manutenção em GSH nos lobos esquerdo e medianos da fígado injectados com PEG-SOD reforça ainda mais o efeito protector do PEG-SOD. Além disso demonstra-se que há um aumento da caspase-3, um produto de apoptose, em tecido exposto a lesão de isquemia-reperfusão. A diminuição da caspase-3 clivada no lobo esquerdo quando tratados com PEG-SOD sugere que o PEG-SOD leva a uma diminuição na apoptose.
superóxido dismutase (SOD) é uma enzima crítica na desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio. A enzima catalisa a conversão de dois aniões superóxido em peróxido de hidrogénio e água. A enzima catalase, em seguida, converte o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio, completando o processo 25. A meia-vida deSOD nativa limita a sua utilização em modelos experimentais até que o desenvolvimento de polietileno glicol superóxido-dismutase conjugado (PEG-SOD). A conjugação da SOD com polietilenoglicol aumenta o seu tempo de meia-vida de 6 min a 14 h. Nguyen et ai. demonstrou a sua capacidade para atenuar a peroxidação lipídica em isquemia hepática num modelo de rato, usando a entrega sistémica 29.
Há uma variedade de potenciais modificações da técnica detalhado aqui e alguns foram previamente descritos na literatura. Dependendo das moléculas modelo usado foram entregues usando inalação 11, a infusão epidural 12, injecção intraperitoneal 17, 18, 21, 22, a administração intravenosa 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 ou injecção na veia mesentérica superior periférica 8.
Existem vários passos críticos neste protocolo. O mais importante é a punção da veia portal. Cuidados devem ser tomados para que o buraco cortado na veia não é muito grande. O tecido é muito elástica e o buraco vai aumentar por conta própria. É recomendável iniciar o corte por um furo que é de 0,5 mm, com uma tesoura de microcirurgia. A cânula pode ser alimentado através do orifício usando um instrumento, o qual permite uma maior agilidade de se tentar efectuar esta porção do processo com a mão. Além disso, enquanto inicialmente alimentando a cânula, deve ser apontado diretamente para a bifurcação das veias porta esquerda e direita para evitar picar um buraco através da parede de trás da veia. Quando a ponta da cânula atinge a bifurcação, que pode então ser alimentado para dentro da veia esquerda específicoaliado. Uma vez que a cânula é introduzida na veia porta esquerda, que fornece tanto a esquerda e lobos medianos, a sua posição pode ser confirmada manualmente, sentindo-lo dentro da veia. A sua posição pode também ser confirmada através da injecção de uma pequena quantidade de solução salina fria e ver o efeito de branqueamento sobre os segmentos fornecidos do fígado.
O modelo de braçadeira hilar do fígado no rato fornece uma plataforma reprodutível e estável para demonstrando lesão isquémica e reperfusão hepáticas. Modelos braçadeira hilares variáveis têm sido utilizados pelos investigadores a estudar os efeitos protectores dos anti-oxidantes e outras pequenas moléculas de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Os pontos de variação incluem qual os vasos são braçadeira ed, que segmento são feitos isquémica, se ou não o ducto biliar está incluído e o comprimento do período de reperfusão de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Além disso, quando este modelo é usado para estudar o impacto da administração de uma molécula da via de administração também é heterogéneo, 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Existem várias vantagens para a abordagem descrita. Em primeiro lugar, a canulação directa do fornecimento portal para o segmento isquémica permite a entrega hepática segmentar directa de a substância farmacológica em estudo. Isto permite a utilização de outros lobos dos fígados como um controlo interno. em segundo lugar, a canulação hepática segmentar permite para um volume reduzido de distribuição para a molécula a ser estudado. Esta abordagem, assim, reduz o risco de efeitos colaterais sistémicos, a substância é injectada directamente para o fígado segmento de interesse. canulação directa do segmento hepático permite para a substância a ser entregue pré-isquemia, Intra-isquemia ou pós-isquemia. Isto permite para o estudo do efeito da molécula em qualquer ponto no ciclo a lesão de isquemia-reperfusão. Com o aumento da duração do tempo de isquemia e aumento do nível de lesão oportunidade adicional para estudar a regeneração hepática estaria disponível.
Há também algumas limitações desta abordagem. O primeiro é o custo start-up. A compra de um microscópio cirúrgico poderia ser um custo significativo start-up para um laboratório que já não possua um. Esta técnica pode ser difícil ou impossível sem um microscópio. O segundo é aprender tempo curva. Embora este procedimento é relativamente simples que requer alguma prática e é provável que um novato vai exigir um número significativo de procedimentos para se tornar um especialista.
Em resumo, este modelo permite uma plataforma reprodutível, simples e de baixo custo para estudar a lesão de isquemia-reperfusão hepática. Embora no protocolo aqui descrito polietileno glsuperóxido-dismutase ycol, um captador de radicais livres 25, foi infundido, este modelo pode ser usado para infundir uma variedade de diferentes substâncias farmacológicas, a fim de avaliar o seu impacto sobre a lesão de I / R no fígado.
The authors have nothing to disclose.
Nós gostaríamos de agradecer Dennis Mathias por seu trabalho ilustrativo. Este trabalho foi financiado pelo NIH T32AI 106704-01A1 eo Fundo T. Flesch de Transplante de Órgãos, Perfusão, Engenharia e Regeneração no The Ohio State University.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |