This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Mantenere l'integrità sezione di impianto è fondamentale per lo studio delle strutture anatomiche dettagliate al cellulare, tissutale, o addirittura a livello di organi. Tuttavia, alcune cellule vegetali hanno pareti cellulari rigide, fibre dure e cristalli (ossalato di calcio, silice, ecc), e alto contenuto di acqua che spesso distruggono l'integrità del tessuto durante il sezionamento tessuto vegetale.
Questo studio stabilisce un metodo semplice di sezionamento del tessuto Hybrid-Cut. Questo protocollo modifica una tecnica di sezionamento a base di paraffina e migliora l'integrità di sezioni di tessuto di piante differenti. tessuti vegetali sono stati inclusi in paraffina prima di sezionamento in un criostato a -16 ° C. Sezionamento a basse temperature irrigidito l'blocchi di paraffina, ridotta lacrimazione e graffianti, e una migliore integrità dei tessuti in modo significativo. Questo protocollo è stato applicato con successo al calcio tessuti orchidea Phalaenopsis ricchi di ossalato, nonché tessuti recalcitranti, come orga riproduttivans e foglie di riso, mais e grano. Inoltre, l'alta qualità di sezioni di tessuto da Hybrid-Cut potrebbe essere utilizzato in combinazione con ibridazione in situ (ISH) fornire modelli di espressione spaziale di geni di interesse. In conclusione, questo protocollo è particolarmente utile per tessuti vegetali recalcitrante contenente alto cristallo o contenuto di silice. sezioni di tessuto di buona qualità permettono studi biologici morfologici e altri.
Il metodo sezionamento a base di paraffina è una tecnica largamente usata per studi anatomici. Conservazione di anatomia tessuto intatto è importante per gli studi morfologici e biologici. La tecnica di sezionamento incluso in paraffina è vantaggioso perché paraffina-embedding conserva cellule e dei tessuti morfologia. Inoltre, i blocchi di paraffina possono essere immagazzinati convenientemente per lunghi periodi di tempo. Tuttavia, sezionamento inclusi in paraffina non è adatto per tessuti vegetali contenenti cristalli intracellulari. I cristalli all'interno delle cellule spesso strappano nastri di paraffina e l'integrità dei tessuti danni durante il sezionamento.
A differenza di sezionamento paraffina, criosezionamento è relativamente veloce e sezioni può essere ottenuto senza fissazione, disidratazione serial o mezzo di inclusione infiltrazione 1. Criosezioni sono compatibili con molte applicazioni, come l'immunoistochimica, ibridazione in situ, e l'enzima istochimica. L'altro vantaggio di criosezionamento èche questo metodo non passa attraverso un potenziale di processi di denaturazione quali temperatura elevata e trattamenti chimici, le molecole in modo cellulari sono ben conservati all'interno delle sezioni di tessuto 2. Criosezionamento è generalmente preferiti a base di paraffina sezionamento per studi in tessuti animali. Tuttavia, criosezionamento non è la prima scelta in piante perché la temperatura di congelamento volte provoca la formazione di cristalli di ghiaccio che influenzano la qualità di integrità sezione. Anche se osmoregulation quali soluzioni di saccarosio, glicole polietilenico (PEG), o glicerolo 3 sono stati riportati per ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio in condizioni di congelamento, il miglioramento è meno che ottimale.
Per adattarsi a diversi ambienti, piante diverse hanno spesso distinte cellule trama del tessuto e vegetali si sono evoluti in modo da formare pareti rigide cellulari, fibre dure e cristalli 4,5. Ad esempio, cristalli di ossalato di calcio insolubile e corpi di silice sono abbastanza comuni inpiante 6. Corpi di silicato / cristalli sono stati segnalati per aiutare a mantenere l'architettura dell'impianto, erectness, e prevenire le malattie o parassiti in piante di cereali 7-9.
Le orchidee in vaso e di mercato orchidea fiori recisi è fiorente, ed è un settore in crescita. Phalaenopsis (falena orchidea) è uno dei più importanti di esportazione piante ornamentali in Taiwan. Notevoli sforzi sono stati fatti per comprendere i cambiamenti morfologici e fisiologici dei processi di fioritura di orchidee Phalaenopsis. Picchi floreali di orchidee Phalaenopsis sono avviate da gemme ascellari alla base delle foglie. Dopo un periodo di temperatura ambiente fresco (circa un mese e mezzo), gemme ascellari ingrandire, rompere dormienza, e sporgono dalla base foglia di trasformarsi in giovani punte floreali. Per capire il fisiologico, cellulare, e processi molecolari di picco iniziazione, è necessario sviluppare un robusto tecnica anatomica visuatessuti Lize o marcatori in modo tempestivo. Tuttavia, la presenza di cristalli onnipresenti nei tessuti orchidea, particolarmente in gemme ascellari, rende il lavoro anatomica difficile.
Qui abbiamo cercato di migliorare la sezione integrità dei tessuti vegetali recalcitranti che sono stati considerati finora tecnicamente impegnativo. Qui vi mostriamo un miglioramento del protocollo chiamato Hybrid-Cut. Si tratta di un metodo di sezionamento a base di paraffina che viene eseguita utilizzando un criostato. incorporamento paraffina risolve elevato contenuto di acqua nei tessuti vegetali. Sezionamento a basse temperature indurisce il blocco di paraffina, riduce cristallo lacrimazione problema, e migliora in modo significativo l'integrità dei tessuti. Questo protocollo migliora notevolmente l'integrità dei tessuti per i campioni di piante recalcitranti.
Le cellule vegetali hanno pareti rigide cellulari, fibre dure, cristalli, e alto contenuto di acqua che causano problemi di strappo dei tessuti durante il sezionamento tessuto vegetale. Anche se sezionamento a base di paraffina viene spesso utilizzato per tessuti vegetali, i cristalli endogeni spesso lacerare il tessuto vegetale durante sezionamento (Figura 1). A causa del contenuto intrinsecamente di acqua alta all'interno delle cellule vegetali, sezionamento criostato a base spesso induce le cellule rotte e sezioni di tessuto incrinate.
Nel presente studio, un combinato di paraffina-embedding e cryosection protocollo chiamato Hybrid-Cut è stato sviluppato e sezioni di tessuto di buona qualità sono stati ottenuti. Questo protocollo risolve il problema connesso con alto contenuto di acqua introducendo paraffina, e riduce l'effetto di strappo da indurimento paraffina a bassa temperatura durante sezionamento (Figura 3). Pertanto, questo protocollo modificato è vantaggioso su entrambi i sectio a base di paraffinaning o criosezionamento per preservare l'integrità dei tessuti della pianta.
Questo manoscritto dimostra che il metodo Hybrid-Cut preserva l'integrità dei tessuti in molti tessuti di orchidea Phalaenopsis, come gemma ascellare, seme, e PLB, ecc che contengono alti livelli di cristalli (figure 3-4). Inoltre, questo protocollo è suscettibile di cereali quali organi riproduttivi e foglie di riso, mais e grano che contengono alto contenuto di silice (figure 5-6). Presumibilmente, questo protocollo può essere applicato alle piante legnose contenenti alto contenuto di fibra.
In generale, il tessuto di fissaggio è completamente molto importante per la Hybrid-Cut. Abbiamo scoperto che l'acido formaldeide-alcol-acido (FAA) fissativo è meglio di PFA per preservare l'integrità dei tessuti di alcuni tessuti recalcitranti, come gemme assialmente, radici, ecc, tuttavia, PFA funziona meglio di FAA nel preservare l'integrità dell'RNA. Pertanto PFA si consiglia di fissarecampione per l'ibridazione in situ di lavoro (ISH). Il protocollo qui descritto è progettato per l'esperimento RNA ISH. Pertanto, tutti i reagenti sono stati preparati per evitare la degradazione dell'RNA eliminando la contaminazione RNasi dal trattamento DEPC. Se la sezione ibrida-Cut è per studi anatomici, osmosi inversa acqua normale (RO) e il suo tampone o reagenti derivati sono accettabili.
Riduzione delle dimensioni del campione e lo spessore di meno di 3 mm è utile per l'infiltrazione. Inoltre, aumentando il tempo di immersione per la disidratazione e l'infiltrazione sono necessarie per i tessuti trama duri. Limitazione di questo protocollo potrebbe a causa di problemi causati dalla fissazione inadeguata, la disidratazione, e l'infiltrazione di campione. Pertanto, la regolazione del tempo di elaborazione per ogni passaggio è fondamentale per la produzione di blocco di paraffina di buona qualità. Normalmente, il tessuto più duro ha bisogno di più tempo di elaborazione rispetto al tessuto più morbido.
Inoltre, abbiamo dimostrato che Hybrid-Cut lavorato con successo in combinazione with ISH per fornire la distribuzione spaziale dei trascritti selezionati (Figura 7). In sintesi, questo protocollo è utile per lo studio dell'anatomia vegetale e fornisce una mappa RNA tessuto-specifica dei geni selezionati. Inoltre, può essere applicato ad altri studi molecolari come saggio terminale deossinucleotidil transferasi dUTP nick etichettatura estremità (TUNEL), ibridazione in situ fluorescente (FISH), e le tecniche di immunoistochimica. In conclusione, questo miglioramento protocollo tessuto sezionamento è sia utile e disponibile per i ricercatori in comunità vegetali.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |