продольный<em> В Vivo</em> Визуализация Cerebrovasculature: Актуальность для заболеваний ЦНС
Summary
Эта рукопись описывает процедуру для отслеживания ремоделирование cerebrovasculature во время амилоидного накопления бляшек в естественных условиях с использованием продольной двухфотонного микроскопии. Препарат разреженных черепа позволяет визуализировать флуоресцентные красители для оценки прогрессирования цереброваскулярной повреждения в мышиной модели болезни Альцгеймера.
Abstract
Ремоделирование сосудов головного мозга является общей чертой патологий головного мозга. В естественных условиях методы визуализации имеют основополагающее значение для выявления сосудов головного мозга или повреждение пластичности происходит сверхурочно и по отношению к активности нейронов или кровотока. В естественных условиях двухфотонного микроскопии позволяет исследовать структурно-функциональной пластичности крупных клеточных единиц в живом мозге. В частности, препарат в разреженных черепа окно позволяет визуализировать корковых областей интереса (ROI), не вызывая значительное воспаление мозга. Повторные сеансы визуализации коркового ROI осуществимы, обеспечивая характеристику признаков заболевания в течение долгого времени при прогрессировании многочисленных заболеваний ЦНС. Этот метод доступа к пиальные структур в пределах 250 мкм мозга опирается на обнаружение флуоресцентных зондов, закодированных с помощью генетических клеточных маркеров и / или жизненно важных красителей. Последние (например, флуоресцентные декстраны) используются для отображения Luminаль отделение цереброваскулярных структур. Germane с протоколом , описанным в данном документе является использование маркера в естественных условиях амилоидных отложений, метоксигруппы-O4, для оценки болезни Альцгеймера (AD) прогрессии. Мы также опишем процесс обработки изображений после приобретения используется для отслеживания изменений сосудистой и амилоидных отложений. Сосредоточив в настоящее время на модели AD, описанный протокол имеет отношение к другим расстройств ЦНС, где происходят патологические изменения сосудов головного мозга.
Introduction
Сосудистая мозг является многоклеточным структура, которая анатомически и функционально связан с нейронами. Динамический ремоделирование сосудов происходит на протяжении развития мозга и во время прогрессирования патологии центральной нервной системы (ЦНС) , в 1,2 раза . Широко распространено мнение , что цереброваскулярные повреждение является признаком ряда заболеваний ЦНС, включая эпилепсию, болезнь Альцгеймера (AD), черепно – мозговой травмой и энцефалит 3,4. Таким образом, отслеживание изменений цереброваскулярных в естественных условиях становится существенным при моделировании заболеваний ЦНС, от начала и в хронической фазе. Как цереброваскулярные изменения часто происходят одновременно с нейронного повреждения или пластичность, визуализация нейро-сосудистую систему представляет ключевую точку входа расшифровывать ЦНС патофизиологии заболевания.
Этот протокол описывает продольную процедуру на основе двухфотонную для отслеживания ремоделирование cerebrovasculature в модели мышиAD, прогрессирующая патология характеризуется цереброваскулярных дефектов на больших и малых калибров сосудов из – за отложения зубного налета амилоидогенного 5-7. Эта процедура позволяет для визуализации амилоидных отложений и отслеживание их положения и роста по отношению к нейрососудистых ремоделирования на протяжении всего течения заболевания. Vital флуоресцентные красители вводят перед каждой сессией визуализации для визуализации cerebrovasculature и амилоидных бляшек у трансгенных мышей AD 8. Повторные сеансы формирования изображения ROI через утонченной окна черепа транскраниальной является неинвазивным и метод выбора для оценки нервно – сосудистого ремоделирования в мозге живой мыши 2,5,9,10.
Ниже описана процедура описывает хирургический протокол, сбора и обработки изображений. Раннее прогрессирование церебральной амилоидной ангиопатии (CAA) в основном при больших лептоменингиальной и проникающих артериол характеризуется.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методика открытого черепа для в естественных условиях двухфотонного микроскопии предлагает преимущество неограниченного количества сеансов визуализации больших полей изображений 13,14. Тем не менее, этот метод также производит воспаление в интересующей области 14, ча?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Ligue Francaise Contre l'Epilepsie (для MA-L), Национальный институт де ла Санте и де-ла-Recherche MEDICALE Грант АВЕНИР R12087FS (для FJ), грант от университета Монпелье (для FJ) и грант от Федерации пур ля Recherche сюр-ле-Cerveau (НМ). Мы признаем техническую помощь Chrystel Lafont на IPAM в естественных условиях основной платформы визуализации объекта Монпелье. Мы также благодарим Мэри Вернов (Weill Cornell Medical College) за вычитку рукописи.
Materials
| methoxy-X04 | tocris | 4920 | use 10 mg/Kg |
| FITC-Dextran 70Kda | sigma | 46945 | use 100 mg/Kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch and Lomb | ||
| micorsurgical blade | surgistar | 6900 | must be sharp and not dented |
| povidone-iodine | betadine | antisceptic solution | |
| binocular stereomicroscope | olympus | SX10 | optimal image contrast is crucial for this procedure |
| 2-photon microscope | zeiss | Zeiss LSM 710mp | |
| fine scissors-toughcut | Fine science tools | 14058-09 | this scissors are optimized for cutting skin and soft tissue |
References
- Harb, R., Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. In vivo imaging of cerebral microvascular plasticity from birth to death. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (1), 146-156 (2013).
- Whiteus, C., Freitas, C., Grutzendler, J. Perturbed neural activity disrupts cerebral angiogenesis during a postnatal critical period. Nature. 505 (7483), 407-411 (2014).
- Masamoto, K., et al. Microvascular sprouting, extension, and creation of new capillary connections with adaptation of the neighboring astrocytes in adult mouse cortex under chronic hypoxia. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 325-331 (2014).
- Marchi, N., Lerner-Natoli, M. Cerebrovascular remodeling and epilepsy. Neuroscientist. 19 (3), 304-312 (2013).
- Giannoni, P., et al. Cerebrovascular pathology during the progression of experimental Alzheimer’s disease. Neurobiol Dis. 88, 107-117 (2016).
- Kimbrough, I. F., Robel, S., Roberson, E. D., Sontheimer, H. Vascular amyloidosis impairs the gliovascular unit in a mouse model of Alzheimer’s disease. Brain. 138 (Pt 12), 3716-3733 (2015).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Liston, C., et al. Circadian glucocorticoid oscillations promote learning-dependent synapse formation and maintenance. Nat Neurosci. 16 (6), 698-705 (2013).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Klunk, W. E., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J Neuropathol Exp Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. J Vis Exp. (71), (2013).
- Holtmaat, A., et al. Long term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Joseph-Mathurin, N., et al. Amyloid beta immunization worsens iron deposits in the choroid plexus and cerebral microbleeds. Neurobiol Aging. 34 (11), 2613-2622 (2013).
- Sadowski, M., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
