En alternativ og valideret Injection Metode til Adgang til subretinarummet<i> via</i> En Transcleral Posterior Approach

Summary

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Abstract

Subretinal injektioner med succes er blevet brugt i både mennesker og gnavere til at levere terapeutiske interventioner proteiner, virale agenter og celler til interphotoreceptor / subretinal kabine, som er direkte udsættelse for fotoreceptorer og retinale pigment epitel (RPE). Subretinal injektioner af plasminogen samt seneste prækliniske og kliniske forsøg har vist sikkerhed og / eller effekt levere virale vektorer og stamceller til personer med fremskreden retinal sygdom. Musemodeller for retinal sygdom, især arvelig retinal dystrofier, er afgørende for at teste disse behandlinger. Den mest almindelige injektionsprocedure hos gnavere er at bruge små transcorneal eller transcleral indsnit med en forreste tilgang til nethinden. Med denne fremgangsmåde, kanylen trænger den neurosensoriske nethinde forstyrre underliggende RPE og indsættelse kan nemt nick linsen, der forårsager linseuklarhed og nedskrivninger på ikke-invasiv imaging. Adgang til subretinarummet via en transcleral, posterior tilgang undgår disse problemer: nålen krydser sclera ca. 0,5 mm fra den optiske nerve, uden retinal penetration og undgår at forstyrre glaslegemet. Collateral skaden er begrænset til, at forbundet med kontaktpunktet sklerotomi og virkningerne af en forbigående, serøs nethindeløsning. Enkeltheden af ​​metoden minimerer okulær skade, sikrer hurtig retinal refiksation og nyttiggørelse, og har en lav dumpeprocent. Den minimale skader på nethinden og RPE muliggør klar vurdering af effekten og direkte effekter af de terapeutiske midler selv. Dette håndskrift beskriver en hidtil ukendt subretinal injektion teknik, der kan anvendes til at målrette virale vektorer, farmakologiske midler, stamceller eller induceret pluripotente stamceller (IPS) celler til subretinarummet i mus med høj effektivitet, minimal skade, og hurtig genopretning.

Introduction

Subretinal injektioner er det primære middel til at levere cellulære og virale agenter til nethinder af mus til at undersøge deres virkninger på fotoreceptorer og underliggende RPE ^1,2. De fleste subretinal injektion protokoller hos mus bruger en transcorneal eller et transcleral injektionsstedet anterior til ækvator (figur 1). Denne fremgangsmåde kan resultere i iboende indirekte skader, som omfatter huldannelse og resulterende uklarhed af linsen, afbrydelse af integriteten af glaslegemet, penetration af neurosensoriske nethinde og iris, retinal blødning, betydelige retinaløsninger og varig subretinal ødem ^3-9. Eksperimentelle manipulationer skal overvinde disse effekter for at vurdere effekten af terapeutiske interventioner ^3,7,10,11. Denne undersøgelse giver en detaljeret beskrivelse og validering af en posterior transcleral injektion metode, der undgår disse komplikationer, minimerer traume og har en høj succesrate for at målrette subretinal plads.

Injektioner målrettet mod subretinarummet i mus er ofte meget vanskeligt at udføre, og de fleste forskere støder på en høj frekvens af mislykkede forsøg, hvor vektoren, som leveres til en forkert placering, eller der er betydelig beskadigelse af nethinden, for eksempel i en fuldstændig nethindeløsning ^6. Antallet af øjne er udelukket fra analysen på grund af injektion komplikationer typisk ikke rapporteret i muse studier, men i vores egne erfaringer og i samarbejde med andre forskere, kan antallet af mislykkede injektioner være så høj som 50% og varierer afhængig af erfaring og kapaciteter af investigator, der udfører injektioner. Succesen af injektionen typisk vurderes ved direkte fundus billedbehandling og / eller optisk kohærens tomografi (OCT) ^7,9. En let mestret metode med høj succesrate for subretinal injektioner i mus kan fremskynde eksperimenter og reducere omkostningerne ved prækliniske studier af treatments for retinale sygdomme, der er vigtige årsager til blindhed i USA.

Den bageste, transcleral beskrevet her subretinal injektionsteknik er en tilpasning fra kliniske og prækliniske protokoller ^9,12. De invasive diagnostiske vurderinger foretaget i injicerede mus demonstrerer mild og meget lokal skader og mangler yderligere sikkerhed linse, retinal og RPE skade. Desuden vil der med relativt lidt praksis, kan en eksperimentator opnå disse resultater med en høj succesrate (80 – 90% eller bedre) og dermed reducere omkostningerne i forbindelse med sådanne undersøgelser. Denne procedure kan anvendes til at levere cellulære, virale, eller farmakologiske terapeutiske interventioner til fotoreceptorer og / eller RPE i prækliniske undersøgelser og til nemt vurdere eksperimentelle interventioner.

Protocol

Dyr: Vild typen C57BL / 6J mus avlet ved University of California i Los Angeles (UCLA). Alle dyr var mellem 11 – 17 uger gammel, og omfattede mandlige og kvindelige mus. Alle mus var i grupper, holdt i en 12:12 lys / mørke cyklus med mad og vand ad libitum. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer UCLA og Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research. BEMÆRK: Alle lægemidler og injicerbare agenter er United State…

Representative Results

Posterior transcleral subretinal injektioner blev udført på 31 sunde øjne fra 16 vildtypemus med injektioner af 0,3 pi (n = 18), 0,5 pi (n = 8) og 1,0 pi (n = 5) på 0,01% fluorescein. Det ene øje var udelukket fra injektion på grund af en allerede eksisterende kornea, der forhindrede strukturel og funktionel analyse. Hver injicerede øje er medtaget i denne rapport. Ingen utilsigtede retinaløsninger, blev påvist punkteringer af neurosensoriske nethinde, eller lækage i glaslegeme…

Discussion

Subretinal injektioner er den foretrukne metode til levering af virale vektorer og stamcelle-afledt terapi for at manipulere fotoreceptorer og RPE i både grundforskning og klinisk behandling. Hos patienter, der subretinal injektioner typisk sker med en forreste sklerotomi ved pars plana, en bageste kernevitrektomi og indtrængning af nethinden af ​​nålen med direkte visualisering. Som med de fleste vitrektomi procedurer, er det almindeligt for kataraktdannelse at forekomme tidligt medmindre øjet er allerede pseud…

Materials

Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Vannas Curved Scissors	Ted Pella, INC.	1347	5mm Blade
22.5 Degree Microsurgery Knife	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100mg/ml
0.9% Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
Antibiotic Ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	Ophthalmic
Water Circulating Pump	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Fundus Camera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Tweezers Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2.5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose 2.5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Eye Drops (Rinse)	Bausch & Lomb		Saline Solution
Microscope	Zeiss	Stemi 2000	Microscope
Light source	Fostec	P/N 20520	Light source