We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.
Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.
To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.
However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.
Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.
يصف بروتوكول الخطوط العريضة لاستنساخ الجينات في المصالح في ناقلات العنونة LAP، وجيل من خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP محرض، وتنقية البروتين المجمعات الموسومة LAP لتحليل البروتين. وفيما يتعلق بالنهج LAP / TAP وضع العلامات الأخرى، وقد تم تبسيط هذا البروتوكول لتكون متوافقة مع النهج الإنتاجية العالية لرسم خريطة توطين البروتين والبروتين البروتين التفاعلات داخل أي مسار الخلوي. وقد تم تطبيق هذا النهج على نطاق واسع على توصيف وظيفي من البروتينات الهامة للتقدم دورة الخلية، الجمعية المغزل الإنقسامية، المغزل قطب التوازن، وتكون الأهداب على سبيل المثال لا الحصر، وقد ساعد على فهم كيفية misregulation من هذه البروتينات يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب الإنسان 15، 16،19،20. على سبيل المثال، لدينا مجموعة استخدمت مؤخرا هذا النظام لتحديد وظيفة وتنظيم كينيسين STARD9 الإنقسامية (هدف السرطان مرشح) في الجمعية المغزل 15،21، لتحديدرابط جزيئي جديد بين سلسلة Tctex1d2 داينين ضوء وقصيرة المتلازمات ضلع كثرة الأصابع (SRPS) 19، وتحديد وجود صلة جزيئي جديد لفهم كيفية تحور اليوبيكويتين يغاز Mid2 يمكن أن يؤدي إلى الإعاقة الذهنية المرتبطة X 16. وأيضا تطبيق غيرها من المختبرات بنجاح هذه الطريقة، بما في ذلك واحدة هي التي تحدد أن Tctn1، المنظم من الماوس القنفذ الإشارات، وكان جزء من مجمع البروتين المرتبط ciliopathy أن الهدبية ينظم تكوين الغشاء وتكون الأهداب في الطريقة التي تعتمد على الأنسجة 22،23. لذلك، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتشريح أي مسار الخلوي.
خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو اختيار خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP التي تقاوم هيغروميسين. وينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان أن جميع الخلايا في لوحة التحكم لقوا حتفهم قبل اختيار بؤر في لوحة التجريبية لتضخيم. هيغروميسين ويمكن اضافتهاد خلال زراعة الخلايا الروتينية من خطوط الخلايا مستقرة الموسومة LAP لزيادة التأكد من أن جميع الخلايا تحافظ على الجينات الموسومة LAP من الفائدة في موقع FRT. ونحن نحذر من أن ليس كل البروتينات الموسومة LAP سوف تكون وظيفية، وأنه من المهم أن يكون فحوصات في المكان التي يمكن استخدامها لاختبار وظيفة البروتين. وتشمل الأمثلة على المقايسات استخدامها لاختبار وظيفة البروتين إنقاذ الظواهر التي يسببها سيرنا وفي المقايسات النشاط في المختبر. لمعالجة أي مشاكل محتملة مع إضافة كبيرة LAP العلامة، ونحن قد ولدت من قبل ناقلات TAP العلامة المتوافقة مع هذا النظام التي تحتوي على علامات أقل، مثل FLAG، والتي هي أقل عرضة للتحول دون وظيفة وتوطين البروتين من الفائدة 4. وبالإضافة إلى ذلك، توجد ناقلات العنونة LAP لتوليد البروتينات الموسومة LAP C-محطة أو البروتينات الموسومة TAP C-الطرفية التي تتوافق مع هذا النظام، والتي يمكن استخدامها في الحالات التي لا يمكن تحمله على LAP / TAP العلامة في ن -terminus من البروتين. بالإضافة إلى ذلك، الالبريد الملح والمنظفات تركيزات مخازن المياه (LAPX N) يمكن تعديلها لزيادة أو تقليل التشدد تنقية إذا لوحظ شيء أو الكثير من التفاعلات. وبالمثل، فإن إجراء تنقية تقارب جنبا إلى جنب هو أكثر صرامة من الإجراءات تنقية وinteractors ضعيفة واحد يمكن أن تضيع، وبالتالي يمكن استخدام نظام تنقية واحد عندما يتم تحديد قليلة أو معدومة interactors.
من المهم أن نلاحظ أن النهج GFP حاتمة علامات أخرى موجودة التي تسمح على نطاق واسع البروتين GFP وضع علامات لتوطين البروتين وتنقية دراسات 24،25. وتشمل هذه النهج BAC TransgenOmics التي تستخدم الصبغيات الاصطناعية البكتيرية للتعبير عن الجينات GFP الموسومة من الاهتمام من بيئتها الأصلية التي تحتوي على جميع العناصر التنظيمية، التي يحاكي التعبير الجيني الذاتية (24). وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت CAS9 / RNA واحد موجهة (sgRNA) المجمعات بروتين نووي ريبوزي (RNPs) لإنهاءعلامة ogenously الجينات في المصالح مع نظام تقسيم GFP التي تسمح للتعبير عن الجينات GFP الموسومة من مواضع الجيني الذاتية الخاصة بهم 25. على الرغم من أن كلا من هذين النهجين تمكين التعبير عن البروتينات الموسومة تحت الظروف المحلية، مقارنة مع بروتوكول LAP وضع العلامات الموصوفة هنا، أنها لا تسمح للتعبير عن محرض والانضباطي من الجينات ذات الكلمات الدلالية المصالح. بالإضافة إلى ذلك، لديهم حتى الآن ليتم تطبيقها على حاتمة جنبا إلى جنب علامات للالتونسية. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن أنظمة العلامات الأخرى كما يمكن تعديلها لتصبح متوافقة مع النظام المذكور هنا لتوليد خطوط الخلايا مستقرة الموسومة حاتمة محرض. على سبيل المثال، قد حصل على تحديد البيوتين التي تعتمد على القرب (BioID) اهتماما كبيرا نظرا لقدرتها على تحديد العلاقات المكانية والزمانية بين البروتينات التفاعل 26. هذه التقنية تستغل اندماج البروتين لسلالة منحل للالاشريكية القولونية البيوتين يغاز البيرة، التي biotinylateق أي البروتين داخل ~ 10 نانومتر دائرة نصف قطرها من الانزيم. البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثم يتم تقارب تنقيته باستخدام القبض على البيوتين تقارب وتحليلها لتكوين بواسطة مطياف الكتلة. سوف البيرة biotinylate أي بروتين على مقربة، حتى عابر، الأمر الذي يجعل من مناسبة خاصة للكشف عن شركاء ضعف التفاعل داخل مجمع (27). بالإضافة إلى ذلك، لا يستلزم نظام تنقية أن الذاتية تفاعلات البروتين البروتين لا تزال سليمة ويمكن تنفيذها في ظل ظروف تغيير طبيعة، وبالتالي تقليل معدل من ايجابيات كاذبة. ضمن البروتوكول الحالي لدينا، يمكن الاستعاضة عن ناقلات pGLAP1 بواسطة ناقل البيرة وضع العلامات تحويل هذا النظام من تحديد تفاعلات البروتين البروتين على أساس التقارب إلى كشفها على أساس القرب. ومن شأن هذا النظام أن يكون مفيدا للغاية للكشف عن التفاعلات البروتينية عابرة كما هو الحال بين كثير من التفاعلات الانزيم الركيزة ولرسم خرائط الزمانية المكانية الأسواق العالمية ضغطها البروتين البروتينractions داخل هياكل محددة كما نفذت لالجسيم المركزي وأهداب 26،28.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
PETG, 5X | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
PETG, 2.5X | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
500 mL conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
4X Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |