जांच प्रोटीन समारोह, spatiotemporal स्थानीयकरण और प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए inducible एलएपी टैग स्थिर सेल लाइन्स
Summary
We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.
Abstract
Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.
Introduction
To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags3. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.
However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.
Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins4. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation5, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO2) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible12.
Protocol
Representative Results
Discussion
उल्लिखित प्रोटोकॉल एलएपी-टैगिंग वेक्टर में ब्याज की जीन की क्लोनिंग का वर्णन है, inducible एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी है, और एलएपी टैग प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन परिसरों की शुद्धि। अन्य गोद / नल-टैगिंग दृष्टिकोण के लिए सम्मान के साथ, इस प्रोटोकॉल उच्च throughput दृष्टिकोण किसी भी सेलुलर मार्ग के भीतर प्रोटीन स्थानीयकरण और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत नक्शा करने के साथ संगत होना करने के लिए सुव्यवस्थित किया गया है। यह दृष्टिकोण व्यापक रूप से कोशिका चक्र प्रगति, mitotic धुरा विधानसभा, धुरी पोल homeostasis, और ciliogenesis के लिए महत्वपूर्ण कुछ ही नाम के प्रोटीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया गया है और कैसे इन प्रोटीनों की misregulation मानव रोगों 15 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की समझ सहायता प्राप्त है, 16,19,20। उदाहरण के लिए, हमारे समूह ने हाल ही धुरी विधानसभा 15,21 में समारोह और STARD9 mitotic kinesin के विनियमन (एक उम्मीदवार कैंसर लक्ष्य) को परिभाषित करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है, एक परिभाषित करने के लिएTctex1d2 dynein प्रकाश श्रृंखला के बीच नए आणविक लिंक और कम पसली polydactyly सिंड्रोम (SRPS) 19, और समझ कैसे Mid2 यूबीक्यूटिन ligase का उत्परिवर्तन एक्स से जुड़े बौद्धिक रूप से विकलांग 16 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के लिए एक नया आणविक लिंक को परिभाषित करने के लिए। अन्य प्रयोगशालाओं भी सफलतापूर्वक इस पद्धति लागू की गई है, एक है कि निर्धारित किया है कि Tctn1, माउस का हाथी संकेतन का एक रेगुलेटर, एक ciliopathy जुड़े प्रोटीन जटिल है कि का एक हिस्सा था सहित विनियमित सिलिअरी झिल्ली संरचना और एक ऊतक निर्भर तरीके 22,23 में ciliogenesis। इसलिए, इस प्रोटोकॉल मोटे तौर पर किसी भी सेलुलर मार्ग के विच्छेदन के लिए लागू किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों है कि hygromycin प्रतिरोधी रहे हैं का चयन है। विशेष देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि नियंत्रण थाली में सभी कोशिकाओं प्रवर्धन के लिए प्रयोगात्मक थाली में foci चयन करने से पहले मर चुके हैं लिया जाना चाहिए। Hygromycin भी adde जा सकती हैडी एलएपी टैग स्थिर सेल लाइनों की दिनचर्या सेल संवर्धन के दौरान आगे सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाओं FRT स्थल पर ब्याज की गोद टैग जीन बनाए रखें। हम चेतावनी देते हैं कि नहीं सभी एलएपी टैग प्रोटीन कार्यात्मक हो जाएगा और यह जगह में assays कि प्रोटीन समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है महत्वपूर्ण है कि। प्रोटीन समारोह का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया assays के उदाहरण siRNA प्रेरित phenotypes के और इन विट्रो गतिविधि assays में बचाव शामिल हैं। एक बड़ी गोद टैग के अलावा के साथ किसी भी संभावित समस्याओं का समाधान करने के लिए, हम पहले इस प्रणाली है कि छोटे टैग, ध्वज की तरह है, जो कम समारोह और ब्याज की प्रोटीन का स्थानीयकरण बाधित होने की संभावना है को रोकने के साथ संगत नल-टैग वैक्टर उत्पन्न किया है 4। इसके अलावा, गोद टैगिंग वैक्टर सी टर्मिनल एलएपी टैग प्रोटीन या सी टर्मिनल नल टैग प्रोटीन है कि इस प्रणाली है, जो मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां एक गोद / नल टैग एन पर सहन नहीं किया है के साथ संगत कर रहे हैं पैदा करने के लिए मौजूद हैं एक प्रोटीन की -terminus। इसके अतिरिक्त, धशुद्धि बफ़र्स (LAPX एन) के ई नमक और डिटर्जेंट सांद्रता बढ़ाने या कोई भी या बहुत अधिक बातचीत मनाया जाता है शुद्धि तंगी कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, मिलकर आत्मीयता शुद्धि प्रक्रिया इस प्रकार एक भी शुद्धि योजना जब कुछ या कोई interactors पहचान कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है, एकल शुद्धि प्रक्रियाओं और कमजोर interactors की तुलना में अधिक कड़े खो दिया जा सकता है।
यह ध्यान रखें कि अन्य GFP मिलान टैगिंग दृष्टिकोण मौजूद है कि बड़े पैमाने पर GFP प्रोटीन प्रोटीन स्थानीयकरण और शुद्धि के अध्ययन के लिए 24,25 टैगिंग की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। ये बीएसी TransgenOmics दृष्टिकोण है कि जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों का इस्तेमाल उनके पैतृक वातावरण से ब्याज की GFP टैग जीन व्यक्त करने के लिए कि सभी नियामक तत्व है, जो mimics अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति 24 शामिल शामिल हैं। हाल ही में, CAS9 / एकल निर्देशित आरएनए (sgRNA) ribonucleoprotein परिसरों (RNPs) अंत इस्तेमाल किया गया हैogenously एक विभाजन GFP प्रणाली है कि उनके अंतर्जात जीनोमिक loci 25 से GFP टैग जीनों की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के साथ ब्याज की जीन को टैग। इन तरीकों के दोनों एलएपी-टैगिंग यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में अंतर्जात की शर्तों के तहत टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सक्षम हालांकि, वे ब्याज की टैग किए गए जीन की inducible और ट्यून करने योग्य अभिव्यक्ति के लिए अनुमति नहीं है। इसके अतिरिक्त, वे अभी तक मिलकर मिलान नल के लिए टैगिंग के लिए लागू किया जाना है। यह भी ध्यान दें कि अन्य टैगिंग सिस्टम भी सिस्टम यहां inducible मिलान टैग स्थिर सेल लाइनों पैदा करने के लिए वर्णित के साथ संगत बनने के लिए संशोधित किया जा सकता है महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, निकटता पर निर्भर बायोटिन पहचान (BioID) बातचीत प्रोटीन 26 के बीच स्थानिक और लौकिक संबंधों को परिभाषित करने की क्षमता के कारण काफी ध्यान हुई। इस तकनीक कोलाई बायोटिन ligase बीरा के एक अनेक तनाव है, जो biotinylate के लिए प्रोटीन fusions कारनामेएक ~ 10 एनएम एंजाइम के दायरे में किसी भी प्रोटीन है। biotinylated प्रोटीन तो आत्मीयता के बायोटिन संबंध कब्जा का उपयोग कर शुद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा रचना के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। बीरा करीब निकटता में किसी भी प्रोटीन biotinylate होगा, भले क्षणिक है, जो इसे विशेष रूप से एक जटिल 27 के भीतर कमजोर बातचीत भागीदारों पता लगाने के लिए अनुकूल बनाता है। इसके अतिरिक्त, शुद्धि योजना की जरूरत नहीं है कि अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बरकरार रहेगा और इस तरह झूठी सकारात्मक की दर को कम करने denaturing शर्तों के तहत बाहर किया जा सकता है। हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर, एक बीरा-टैगिंग वेक्टर द्वारा pGLAP1 वेक्टर के प्रतिस्थापन उन्हें निकटता के आधार पर पता लगाने के लिए समानता के आधार पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने से इस प्रणाली को बदल सकता है। इस तरह की एक प्रणाली क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए बेहद फायदेमंद होगा कई एंजाइम सब्सट्रेट के बीच बातचीत और spatiotemporal प्रोटीन, प्रोटीन inte मानचित्रण के लिए मामला हैपरिभाषित संरचनाओं के रूप में केंद्रपिंड और सिलिया 26,28 के लिए बाहर किया गया है भीतर ractions।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645 (JZT), any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Flp-In T-REx Core Kit | Invitrogen | K6500-01 | Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression |
| PETG, 5X | Nunc, Inc. | 73520-734 | Roller bottle for growing cells |
| PETG, 2.5X | Nunc, Inc. | 73520-420 | Roller bottle for growing cells |
| Cell stackers | Corning CellSTACK | 3271 | Cell stacker for growing cells |
| 500 mL conical centrifuge tubes | Corning | 431123 | Tubes for harvesting cells |
| Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | Rabbit anti GFP antibody |
| Affiprep Protein A beads | Biorad | 156-0006 | Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies |
| Dimethylpimelimidate (DMP) | ThermoFisher Scientific | 21667 | Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads |
| TLA100.3 tubes | Beckman | 349622 | Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step |
| TEV protease | Invitrogen | 12575-015 | Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins |
| Precession Protease | GE Healthcare | 27-0843-01 | Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins |
| S-protein agarose | Novagen | 69704 | Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes |
| QIAquick DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704/28706 | For use in purifying PCR products from an agarose gel |
| BP clonase II | Invitrogen | 11789020 | Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector |
| LR clonase II | Invitrogen | 11791020 | Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector |
| ccdB Survival 2 T1R E. coli | Invitrogen | A10460 | Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | Transfection reagent for transfecting vectors into human cells |
| Tetracycline | Invitrogen | Q100-19 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Doxycycline | Clontech | 631311 | Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | Drug for selecting stable LAP-tagged integrants |
| Kanamycin | Corning | 61-176-RG | Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-5 | Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies |
| 4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels | Biorad | 4561094 | Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates |
| Silver Stain Plus Kit | Biorad | 1610449 | Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process |
| Coomassie Blue stain | Invitrogen | LC6060 | Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible |
| Shuttle vector pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest |
| Flippase expressing vector pOG44 | Invitrogen | V600520 | Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 1610747 | Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix |
| Luria broth (LB) media | Fisher | BP9723-2 | Used for growing DH5α bacteria |
| DNA miniprep kit | Promega | A1222 | Used for making DNA plasmid minipreps |
| DMEM/F12 media | Hyclone | SH30023.01 | For growing Hek293 human cells |
| FBS lacking Tet | Altanta Biologicals | S10350 | Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines |
| Trypsin | Hyclone | SH30042.01 | For lifting Hek293 cell foci from plates |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | Used for making protocol buffers, EDTA-free |
| 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol | Roche | 11332473001 | Used for making protocol buffers |
| PBS | Corning | 21-040-CM | Used for making protocol buffers |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | Used for making protocol buffers |
| Sodium Borate | Fisher | S249-500 | Used for making protocol buffers |
| Boric Acid | Fisher | A78-500 | Used for making protocol buffers |
| Ethanolamine | Calbiochem | 34115 | Used for making protocol buffers |
| NaCl | Fisher | P217-3 | Used for making protocol buffers |
| KCl | Fisher | BP358-10 | Used for making protocol buffers |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172-25 | Used for making protocol buffers |
| MgCl2 | Fisher | M33-500 | Used for making protocol buffers |
| Tris base | Fisher | BP152-5 | Used for making protocol buffers |
References
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