Incelenmesi Protein Fonksiyonu, Spatiotemporal Yerelleştirme ve Protein Etkileşim Ağları için İndüklenebilir LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları

Summary

We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.

Abstract

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein’s spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.

Introduction

To investigate the cellular function of an uncharacterized protein it is important to determine its in vivo spatiotemporal subcellular localization and its interacting protein partners. Traditionally, single and tandem epitope tags fused to the N or C-terminus of a protein of interest have been used to facilitate protein localization and protein interaction studies. For example, the tandem affinity purification (TAP) technology has enabled the isolation of native protein complexes, even those that are in low abundance, in both yeast and mammalian cell lines^1,2. The localization and affinity purification (LAP) technology, is a more recent development that modifies the TAP procedure to include a localization component through the introduction of the green fluorescent protein (GFP) as one of the epitope tags³. This approach has given researchers a deeper understanding of a protein’s subcellular localization in living cells while also retaining the ability to perform TAP complex purifications to map protein-protein interaction networks.

However, there are many issues associated with the use of TAP/LAP technologies that has hampered their widespread use in mammalian cells. For example, the length of time that is necessary to generate a stable cell line expressing a TAP/LAP tagged protein of interest; which typically relies on cloning the gene of interest into a viral vector and selecting single cell stable integrants with the desired expression level. Additionally, many cellular pathways are sensitive to constitutive protein overexpression (even at low levels) and can arrest cells or trigger cell death over time making the generation of a TAP/LAP stable cell line impossible. These and other constraints have impeded LAP/TAP methodologies from becoming high-throughput systems for protein localization and protein complex elucidation. Therefore, there has been considerable interest in the development of an inducible high-throughput LAP-tagging system for mammalian cells that takes advantage of current innovations in cloning and cell line technologies.

Here we present a protocol for generating stable cell lines with Doxycycline/Tetracycline (Dox/Tet) inducible LAP-tagged proteins of interest that applies advances in both cloning and mammalian cell line technologies. This approach streamlines the acquisition of data with regards to LAP-tagged protein subcellular localization, protein complex purification and identification of interacting proteins⁴. Although affinity proteomics utilizes a wide range of techniques for protein complex elucidation⁵, our approach is beneficial for expediting the identification of these complexes and their native interaction networks and is amenable to high-throughput protein tagging that is necessary to investigate complex biological pathways that contain a multitude of protein constituents. Key to this approach are advancements in cloning strategies that enable high fidelity and expedited cloning of target genes into an array of vectors for gene expression in vitro, in various organisms like bacteria and baculovirus, and in mammalian cells^6,7. Additionally, the ORFeome collaboration has cloned thousands of sequence validated open reading frames in vectors that incorporate these advances in cloning, which are available to the scientific community^8-11. In our system, the pGLAP1 LAP-tagging vector enables the simultaneous cloning of a large number of clones, which facilitates high-throughput LAP-tagging. This expedited cloning procedure is coupled to a streamlined approach for generating cell lines with LAP-tagged genes of interest inserted at a single pre-determined genomic locus. This makes use of cell lines that contain a single flippase recognition target (FRT) site within their genome, which is the site of integration for LAP-tagged genes. These cell lines also express the tetracycline repressor (TetR) that binds to Tet operators (TetO₂) upstream of the LAP-tagged genes and silences their expression in the absence of Dox/Tet. This allows for Dox/Tet inducible expression of the LAP-tagged protein at any given time. Having the capability of inducible LAP-tagged protein expression is critical, since many cellular pathways are sensitive to the levels of critical proteins governing the pathway and can arrest cell growth or trigger cell death when these proteins are constitutively overexpressed, even at low levels, making the generation of non-inducible LAP-tagged stable cell lines impossible¹².

Protocol

Not: ilgi herhangi bir protein için uyanlabilir LAP-etiketli Kararlı hücre çizgileri üretimi genel bir bakış, Şekil 1 'de gösterilen ve LAP-takılı protein ekspresyonu, saflaştırılması ve kütle proteomik hazırlık genel görünüşü Şekil 3'te gösterilmiştir analizleri. 1. LAP-etiketi Vektörü içine İlgi konusu genin açık okuma çerçevesinin (ORF) Klonlama Mekik vektörüne İlgi geninin ORF klonlanması. N-terminali füzyon ya da C-terminali füzyon biri için primerler içinde uygun attB1 ve attB2 siteleri ile ilgi dahilindeki ORF öğesini amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanarak. PCR, aşağıdaki koşullar astar dizileri ve Tablo 2 Tablo 1'e bakınız. Jel bir% 1 agaroz jeli üzerinde bunları çözme PCR ürünleri temizler. jelden doğru boyutu güçlendirilmiş bant tüketim ve DNA g kullanılarak jel dilim ayıklamaküreticinin talimatlarına göre el çıkarma kiti. Mekik vektörü ihtiva eden bir attP ve PCR ürünleri, üreticinin talimatlarına göre vektöre rekombine sağlar rekombinaz PCR ürünlerini ihtiva eden saflaştınlmış attB inkübe (MALZEMELERİNİN Tablo). NOT: Boş mekik vektörler ve LAP-etiketleme vektörleri CCD B genini içeren ve CCD B dirençli bakteri hücrelerinde dağıtılmasını gerekir (Malzeme Tablo). Bir ORF bu vektörlere sokulur Ancak ccdB geni klonlanmış ORF olan vektörler yayılan olduğunda bu nedenle standart DH5α E.coli hücreleri kullanmak, üzerinden yeniden oluşturulur. Luria etsuyu (LB) 50 mg agar / ml kanamisin 13 üzerine dönüştürülmüş hücrelerin reaksiyon ürünü 1 ul DH5α E.coli hücrelerini dönüştürmek ve levha. Kanamisin dirençli koloniler seçin. LB beni seçilen koloniler büyütün50 mg / ml kanamisin ile çap, bir DNA mini hazırlık yapmak ve Tablo 3'te listelenen sıralama primerleri kullanılarak DNA dizilemesi ile gen entegrasyonu teyit etmektedir. LAP-etiketi Vektörü içine mekik vektöründe İlgi konusu genin transferi. LAP-etiketi vektör ve uygun olarak LAP-etiketi vektörü içine mekik vektöründe ilgi konusu genin transferi aracılık rekombinazın (Füzyon N-terminali için pGLAP1) faiz ORF dizisi doğrulanmış genini içeren mekik vektörü inkübe üreticinin talimatlarına (Malzeme). Not: İstenilen promoteri, epitop etiketi göre kullanılabilecek LAP / TAP vektörler bir dizi ve N ya da C-terminali etiketleme Tablo 4'te bulunabilir. 100 mg / ml ampisilin 13 LB agar plakası üzerine dönüştürülmüş hücrelerin reaksiyon ürünü 1 ul DH5α E.coli hücrelerini dönüştürmek ve levha. Ampisilin dirençli Colo seçinnies. Ve 100 mg / ml Ampisilin ile LB ortamında seçilmiştir koloniler büyümeye bir DNA mini hazırlık yapmak ve Tablo 5'te listelenen sıralama primerleri kullanılarak DNA dizilemesi ile gen entegrasyonu teyit etmektedir. İlgi LAP-etiketli Gene ifade bir indüklenebi- Kararlı Hücre Hattı 2. Nesil ilgi proje için en uygun hücre satırı seçin. Alternatif olarak, yapısal TetR ifade ve (Malzeme) ilgi LAP-etiketli gen stabil genomuna entegre sağlayan bir FRT bölgesini içeren herhangi bir mevcut hücre hattından bir konak hücre çizgi oluşturmak. NOT: Bu protokol, 4 [Tetrasiklin (-Tet) yoksun,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile yapılan] -Tet DMEM / F12 ortamında yetiştirilir TetR bir FRT bölgesini içeren bir HEK293 hücre çizgisi kullanılır . Higromisin minimum konsantrasyonu belirlemek 2 çiş 1 içinde konak hücre hattını öldürmek için gerekliilaç ilavesini takip eden KS. konsantrasyonu çok 100 mi ug / 800 ug / ml arasında değişen olan konakçı hücre hatları arasında değişebilir. Not: 37 ° C ve% 5 CO2 1-2 hafta içinde ölür 100 ug / ml Higromisin ile -Tet DMEM / F12 ortamında yetiştirildi HEK293 hücreleri. Eş-transfekte flippase rekombinaz bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HEK293 hücrelerine LAP-etiketli vektörü (hücre genomu içinde bir FRT bölgesini içine ilgi LAP-işaretli genin entegre aracılık) ifade vektörü ve üretici talimatlarına göre . 4 oranını kullanın: rekombinaz vektörü 1 LAP vektörü 14. NOT: Optimum oran transfeksiyon konakçı hücre hattı ve yöntemine bağlıdır ve bir titrasyon gerektirir. 4: 1'lik bir oranı çoğu hücre hatları için çalışır. Bir negatif kontrol olarak, bir yalancı-transfekte plaka içerir. Bir gün post-transfeksiyon, taze ortam ile -Tet DMEM / F12 ortamı değiştirin. İki gün sonrası transfecti% 25 izdiham, split hücreler üzerinde. hücreler, takmak için 5 saat, o zaman adım 2.2 önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda Higromisin içeren -Tet DMEM / F12 ortamı ilave izin verin. HEK293 için hücreler, 100 ug / ml Higromisin kullanımı. Not: HEK293 hücre çizgisi ihtiva eden FRT da blasticidin direnç ile ilişkilidir, bu nedenle 5 mg / ml Blasticidin TetR seçmek için ve sızan ifade en aza indirmek için, stabil hücre hattı seçim sürecinde kullanılan TetR içerir. farklı hücre odakları şeffaf plaka karşı opak noktalar benzediğine görünene kadar gerektiği gibi -Tet DMEM / F12 ortamı Higromisin içeren değiştirin. 200 ul pipetlemeyin ucu ile her hücre odaklarının üstüne tripsin 20 ul ekleyin ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı 2 kez. Talep 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücre ve Higromisin içeren -Tet DMEM / F12 ortamı sürekli büyüme hücreleri genişletmek. Sabit hücre veya canlı hücre floresan mikroskop ile uyarılabilir LAP-etiketli protein ekspresyonu için ekran hücreleri ve / veyaLAP-etiketi 15 içinde GFP etiketi için Western blot. LAP-etiketli Protein Kompleksleri 3. saflaştırılması NOT: Bir önceki deneyime dayalı tipik bir LAP-etiketli protein saflaştırılması için kullanılan şartlar ve birimlerde aşağıdaki LAP-etiketli protein saflaştırma protokolü ayrıntıları öneriler. Bununla birlikte, dikkatli ampirik optimizasyon en iyi sonuçlar sağlamak için bir çıkar protein kompleksi ve protein ekspresyon düzeyi için gerçekleştirilir sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Hücre Büyümesi ve Hücre Hasat. Sürekli, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde -Tet DMEM / F12 ortamı içinde daha büyük bir paneli ve / veya silindir şişelerde içine tüm HEK293 hücreleri pasajlanarak, protein kompleksleri TAP izolasyonu için geçerli LAP-etiketli hücre hattı genişletmek. Tet / DOX uyarılabilir hücre çizgileri için, harvestin önce, 0.2 mg / ml Tet / DOX hücrelere ulaşmaya ~% 70 ortak akışkanlığa bir konsantrasyonda 10-15 saat boyunca teşvikg kadar hücre. NOT: konsantrasyon ve indüksiyon süresi her protein için tespit edilmelidir, 10-15 saat boyunca 0.1-1 mg / ml Tet / Dox bir titrasyonu tavsiye edilir. ajitasyon ya da trypsinization ve pelet hücreleri 5-10 dakika boyunca 875 xg'de tarafından Hasat hücreleri. Kavrama anti-GFP, antikor proteininin bir Beads Bir 0.5 ml'lik hücre topağından hazırlanabilir lizat, paketlenmiş hücre hacmi (PCV) için immüno-çökeltme için antikorun 40 ug kullanın. Not: diğer faktörlerin yanı sıra LAP-etiketli protein bolluğu bağlıdır gereken antikor miktarı ve optimizasyon gerektirir. 10-40 ug bir titrasyonu tavsiye edilir. 1.5 ml bir tüp içinde PBST (PBS +% 0.1 Tween-20) içine 160 ul paketlenmiş hacmi (PV), Protein A boncuk dengelenmesi. PBST 1 ml ile 3 kez yıkanır. Not: Buradaki tüm yıkamalar 10 saniye boyunca 5000 x g'de boncuk santrifüjle gerçekleştirilir. Süspanse boncuklar 500 ul PBST ve afinite 80 ug ekleyin160 ul boncuk her tüpe -purified tavşan anti-GFP antikoru. Oda sıcaklığında 1 saat (RT) karıştırılır. PBST 1 ml boncuk 2 kez yıkayın. Daha sonra, 0.2 M sodyum borat, pH 9 (20 ml 0.2 M sodyum-borat-+ 15 ml 0.2 M borik asit) 1 ml boncuk 2 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 1 ml nihai hacim getirmek için 0.2 M sodyum borat 900 ul, pH 9 ekleyin. 20 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 220 mM dimethylpimelimidate (DMP), 100 ul ekle. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça tüpler döndürün. 220 mM DMP için, 0.2 M sodyum borat, pH 9 877 ul 50mg şişe içeriğini tekrar süspansiyon ve boncuk süspansiyonu hemen ekleyin. DMP ile inkübe edildikten sonra, bakiye çapraz bağlayıcı inaktive edilmesi için 0.2 M etanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8.5, 1 ml boncuklardan 1 kez yıkayın. aynı tampon ile 1 ml içinde süspanse boncuklar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca döner. Pelet boncuk ve 0.2 M etanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8.5, 500 ul içinde süspanse boncuklar. Boncuk Severa stabildir4 ° C'de l aydır. Hücre parçalama ve Kompleks Arıtma için Tamponlar hazırlanması pH 7.4 çözeltisi yaparak (hücre parçalama 300 mm, ve en kordon yıkama için 200 mm ve yıkama boncuk 100 mM elüsyon öncesinde proteinleri X LAP tampon maddesi arzu edilen tuz konsantrasyonu, [mM KCI] IS) LAPX tamponlar hazırlamak 50 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), X mM KCI, 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol ihtiva etmektedir. NOT: Bu tampon bileşenleri canlı hücre ortamı yaklaşık kullanılmaktadır. HEPES 7.2-8.2 pH öfke bir tampon olarak kullanılır. KCI tamponunun iyonik mukavemetini muhafaza etmek için kullanılan bir tuzudur. EGTA magnezyum göre kalsiyum seviyelerini azaltmak için kalsiyum iyonu bağlanan bir kenetleme maddesidir. Gliserol ve MgCl2, proteinlerin stablitesini geliştirmek için kullanılmaktadır. % 0.05 nonil phenoxypol ekleyerek LAPX K tamponu hazırlayınLAPX tampon yethoxylethanol. Not: Nonil phenoxypolyethoxylethanol proteinleri çözünür bir deterjan, ancak bu şekilde daha yüksek bir konsantrasyonu ekstraksiyon işlemi sırasında kullanılan, protein-protein etkileşimleri, koruyan ve daha sonra bağlayıcı ve yıkama adımları sırasında azaltılır. Hücre lizatlarının Hazırlanması 0.5 mM ditiyotreitol (DTT) ve proteaz inhibitörleri ile LAP300 2.5 ml PCV 500 ul yeniden süspanse edin. % 10 nonil phenoxypolyethoxylethanol (son% 0.3) 90 ul ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. 10 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. 10 dakika için 21,000 x g'de santrifüjleyin. Bu düşük hız süpernatant (LSS) toplayın. Jel analizi için LSS bir 10 ul örnek almak. 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca 100,000 x g'de bir TLA100.3 tüp ve spin LSS aktarın. bir boru, bu yüksek hızlı süpernatant (HSS) toplayın ve buz üzerine yerleştirin. Jel analizi için HSS bir 10 ul örnek almak. NOT: en üst lipit tabaka almaktan kaçınınd en alttaki hücre enkaz tabakası. lipidlerindeki HSS toplanmadan önce vakum aspirasyon ile çıkarılmalıdır. İlk Affinity Yakalama: Anti-GFP Boncuk bağlanma Ön-elute antikoru bağlı boncuklar bağlanmamış kurtulmak için elüsyon tamponu [20 mM Tris, pH 7.4 ile 3.5 M MgCl2] 1 ml olanağına 3 kez yıkanarak (0.5 mi hücre peleti (PCV) her boncuk 160 ul kullanın) antikorlar ve arka plan azaltır. çabuk yapın. uzun süre yüksek tuz boncuk bırakmayın. LAP200 N, 1 ml boncuk 3 kez yıkayın. HSS 4 ° C 'de 1 saat süre ile, antikor boncuklar ile ekstrakte karıştırın. 10 dakika için 21,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatan 10 ul örneği almak (yani, (FT) üzerinden akış) jel analizi için. 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml boncuk 3 kez yıkayın. 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml boncuk 2 kez (her biri 5 dakika) yıkanır. 2 t çabucak yıkayın1 0.5 mM DTT ile LAP200 ml N, tütün dağlama virüsünün (TEV) proteaz eklemeden önce proteaz inhibitörleri ile katı daha. TEV Dilinim LAP200 N, 1 ml 10 ug TEV proteaz ile seyreltilir ve gece boyunca 4 ° C'de tüpler döndürün. NOT: Bu adım, LAP-etiketli protein için optimize edilebilir LAP-etiketli protein kompleksleri korunması yardımcı olabilir TEV proteaz konsantrasyonu ayarlanarak birkaç saat içinde tamamlanması. yeni bir tüp Pelet boncuk ve transfer süpernatant. Herhangi bir artık proteinin ayrılması için 0.5 mM DTT ile 160 ul LAP200 N ve proteaz inhibitörleri (üç konsantrasyon) ile iki kez boncuk durulayın. jel analizi için süpernatan 10 ul numune alın. İkinci afinite yakalama: S proteini agaroza Bağlama 80 ul S proteini agaroz bulamacın 1 tüp (40 ul paketlenmiş reçine) LAP200 N, 1 ml ile 3 kez yıkanır. NOT: S protEin aktif RNAaz ari tekrar eski halini alır, S-etiketi bağlanabilen ve alternatif bir ikinci epitopu etiketi RNA ihtiva eden protein kompleksleri dikkate alınmalıdır. Ekle TEV 4 ° C sıcaklıkta 3 saat S proteini agaroz boncuklar ve kaya supernatant yıkandı. Pelet boncuklar ve 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml ile 3 kez yıkanır. LAP100 1 ml boncuk 2 kez yıkayın. Protein elüsyonu 10 dakika boyunca 97 ° C'de 4 x Laemmli numune tampon maddesi ve ısı 50 ul ekleyerek agaroz S proteini proteinler, Zehir. Not: Proteinler elüsyon tamponu (20 mM Tris, pH 7.4 ile 3.5 M MgCI2) boncuklardan elüte edilebilir. 4. Kütle Spektrometresi Analizi Proteinler etkileşim tanımlayın (bakınız, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), gümüş boyama jel toplandı numunelerinin analiz ile saflaştırma kalitesini test <strong> Malzeme Tablosu) ve eluatları immün ve bakınız Şekil 4, LAP-etiketli arıtma 16 çalıştı emin olmak için anti-GFP antikorlar ile sondalama ile. stokiyometrik ve altstoikiometrik ortak arıtma türlerini tanımlamak için, nihai elüsyon örnek almak ve SDS-PAGE ile ayırın. Bir kütle spektrometresi uyumlu protein boyası ile jel Leke. En önemli bantları ve jelden aralarında boşluk tüketim ve kütle spektrometresi ayrı ayrı 16 ile analiz için onları süreci. NOT: son saflaştırma eluatları ayrılması ve kütle spektrometresi 5 için onları hazırlamak için çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır. Örneğin, LAP-arıtılmış, kompleksleri, yüksek tuz (3.5 M MgCI2) ve kitle halinde kütle spektrometrisi 17 ile analiz edilebilir en bütün protein popülasyonu kullanılarak S-proteinini tanelerden elüt edilebilir. Alternatif olarak, nihai sıvı kısımlar 1 SDS-PAGE ile mm ve e değişen tek bir 1mM bandı için ayrılabilirxcised ve analiz edildi. Bu analiz engel olacak bir boncuk veya tanecikli maddenin kompleks bir karışımı temizler.

Representative Results

Bu sistemin yardımcı vurgulamak için, Tau mikrotübül bağlama proteini açık okuma çerçevesi (ORF) sahip PCR ürünleri attB1 ve attB2 bölgelerini içeren primerler ile Tau ORF'nin büyütülmesi (Tablo 1) ve kuluçkalama ile mekik vektörüne klonlanmıştır mekik vektörü ve mekik vektörüne PCR ürünlerinin sokulmasını aracılık eden bir rekombinaz. Reaksiyon ürünleri Tau takılmasını sağlamak için dizilenmiştir Kanamisin dirençli koloniler DH5α bakteriler 13 ve plazmid DNA dönüştürmek için kullanılmıştır. Dizisi doğrulanmış mekik Tau vektör daha sonra, pGLAP1 vektörü ile mekik Tau vektör inkübe edilerek LAP (EGFP-TEV-S-protein) etiketi ile çerçeve içinde Tau kaynaşık pGLAP1 vektörü içine Tau ORF aktarmak için kullanılan ve pGLAP1 servis vektöründen ORF transferine aracılık rekombinaz. Reaksiyon ürünleri DH5α bakterilerini transforme etmek için kullanılmıştırAmpisilin dirençli koloniler 13 ve plazmid DNA LAP-tau füzyon çerçeve içinde olmasını sağlamak için dizilenmiştir. Sıra pGLAP1-LAP-Tau sonra tek flippase tanıma hedef LAP-etiketli genler için entegrasyon sitedir kendi genomu içinde (FRT) sitesi, içerdiği HEK293 hücrelerine flippase rekombinasyon enzimi ifade eden bir vektör ile transfekte eş oldu valide 14. Bu hücre hattı ayrıca LAP-işaretli genlerin yukan tet operatörü bağlanır ve Tet / Dox yokluğunda kendi ekspresyonunu susturduğu TetR ifade edilmiştir. Kararlı bütünleyicilerin 5 gün boyunca 100 ug / ml Higromisin ile -Tet DMEM / F12 ortamı ile seçildi. Bağımsız Higromisin dirençli hücre odakları üzerine tripsin 20 ul ilave edilmesi ve aşağı 2 kere pipetleme ile toplandı. Hücreler, 24 gözlü bir plaka içerisine yerleştirildi ve -Tet DMEM / F12 ortamı sürekli büyüme genişletilmiştir. Higromisin dirençli hücre doğrulamak içins LAP-Tau ifade edebilen edildi, HEK293 LAP-tau hücreler 15 saat ve protein ekstreleri için 0.1 ug / ml Dox ile indüklenmiştir kaynaklı-olmayan ve Dox kaynaklı hücrelerinden hazırlandı. Bu ekstreler bir PVDF membrana aktarıldı, SDS-PAGE ile ayrılmış ve yükleme kontrolü olarak GFP ve tubulin imünoblotlanır. Şekil 4A, LAP-Tau görüldüğü gibi (anti-GFP antikorları ile görselleştirilmiştir) Sadece Dox mevcudiyetinde ifade edildi. Daha önce endogen tau'nun 18 gösterilmiş olduğu gibi LAP-tau düzgün mitoz sırasında mitotik mikrotübül mili ile sınırlı olduğu doğrulamak için, HEK293 LAP-tau hücreleri 15 saat için 0.1 | ig / ml Dox ile indüklenmiştir ve hücreler,% 4 ile sabitlendi paraformaldehit ve birlikte lekeli DNA (Hoechst 33342) ve bunun mikrotübüller (anti-tubulin antikor) dir. Tutarlı, LAP-Tau mitoz metafaz (Şekil 4B) sırasında mitotik iğ lokalize edilmiştir. LAP-Tau ve etkileşim proteinler doğrulamak için bu sys ile saflaştırılmış olabilirTEM, HEK293 LAP-tau hücreleri, çalkalama ile toplandı, 15 saat süre ile 0.1 ug / ml Dox ile indüklenen, silindir şişeler için ~% 70 konfluansa büyütüldü LAP300 tamponuyla lize ve tur-tau yukarıdaki protokol kullanılarak arıtıldı. LAP-tau saflaştırmadan elde edilen yıkama sıvıları, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş ve jel gümüş lekeli. Şekil 4C Yıldız ile işaretli LAP-Tau arıtma, LAP-Tau ve Tau etkileşen proteinlerin göstergesidir görülebilir birçok bantları olduğunu gösterir. Şekil 1: İlgi herhangi Protein LAP-etiketli indüklenebi- Kararlı Hücre Hatlarının Kuşağı bakış. ilgi genlerinin açık okuma çerçevesi (ORF) attB1 ve attB2 siteleri sırasıyla 5 've 3' ucu dizilerinin, eteklenen ile amplifiye edilir (primer dizileri verilmektedir Tablo 1) ve klonlanmıştır mekik vektörü. söz konusu gen ile dizi belirlenmiş mekik vektörleri daha sonra pGLAP1 vektörüne ilgi gen transferi için kullanılır. ilgili gen ile pGLAP1 vektörü belirlenmiş dizisi daha sonra tek bir flippase tanıma hedef tur için entegrasyon edilir genomları içinde (STT) mevkisini ihtiva istenen hücre hattı flippase rekombinazı ihtiva eden bir vektör ile birlikte transfekte olan etiketli genler. Bu hücre hatları da LAP-etiketli genlerin yukarı Tet bastırıcı Tet operatörleri bağlanan (TetR) (TETO 2) ifade ve Tet / Dox yokluğunda onların ifadesini susturur. ilgi LAP-etiketli gen daha sonra FRT sitesine recombined ve istikrarlı integrants Higromisin ile seçilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/> Şekil 2: LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları için Uygulamalarına Genel Bakış. LAP-etiketli uyarılabilir stabil hücre hatları Dox ilavesiyle ilgi LAP-etiketli protein eksprese etmek için uyarılan ve hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde senkronize edilebilir veya arzu edilen herhangi bir sinyalleme yolunun aktive edilmesi ya da kimyasal ligandlar ile uyarılabilir. ilgi LAP-etiketli proteinin hücre içi lokalizasyonu canlı hücre ya da sabit bir hücre görüntüleme ile analiz edilebilir. LAP-etiketli proteinler, ikili afinite saflaştırılmış ve etkileşim proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) ile tespit edilebilir olabilir. Son olarak, Cytoscape yem protein, bir protein-protein etkileşimi ağı oluşturmak için de kullanılabilir. Dox TEV TEV proteaz bölünme sitesini gösterir EGFP yeşil flüoresan protein gelişmiş gösterir, IP immünopresipitasyon gösterir, doksisiklin gösterir ve S S-etiketini gösterir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: Kütle Spektrometre için LAP-etiketli Protein Ekspresyonu, Saflaştırılması ve Hazırlanması Genel Bakış. LAP-etiketli protein ekspresyonu 1) büyüme ve indüksiyonu lizatlarının, 2) hücre hasat ve parçalama, 3) hazırlanması, 4), anti-GFP tanelere lizatları bağlanması, 5) TEV proteaz bölünme: 9 protokolü basamaklıdır GFP-eklentisi, 6), S-proteini tanelere lizatları bağlanması, 7) yem protein ve etkileşen proteinleri ve 8-9) kütle spektrometrisi bazlı proteomik analiz için numune hazırlanması elüsyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </p> Şekil 4: LAP-Tau ifade doğrulanması. (A), Western Blot (WB), sırasıyla, LAP-etiketli Tau protein ve tubulin yükleme kontrolü tespit etmek için bir anti-GFP ve anti-tubulin antikor ile problanmıştır neden kaynaklı-olmayan ve Dox LAP-tau HEK293 hücrelerinden protein örneklerinin analizi. Hücreler Dox ile uyarılan zaman LAP-Tau sadece ifade edilir unutmayın. LAP-tau'nun (B) Mitotik hücreler sabitlendi ve birlikte lekeli anti-tubulin antikor ve LAP-tau hücre içi lokalizasyonu ile DNA (Hoechst 33342) ve tubulin (döşeme) için floresan microcopy ile analiz edilmiştir. LAP-Tau mitoz sırasında mitotik iğ ve iğ kutuplara lokalize edin. (C), gümüş LAP-tau arıtma jel boyandı. MA, molekül ağırlığı gösterir CL temizlenir lizatları ve E Hint gösterirates nihai sıvı kısımlar. Örnekler 4-20% SDS-PAGE üzerinde yapılır ve jel gümüş saflaştırılmış proteinler görselleştirmek için boyandı. LAP-Tau karşılık gelen bir grup bir yıldızla ve görülebilir proteinlerin-saflaştırılması eş karşılık gelen diğer bazı gruplarla işaretli olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. N-terminali füzyon ileri 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG – (> 18gsn) -3 ' Ters 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA – (> 18gsn) -3 ' C-terminali füzyonu ileri 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC – (> 18gsn) -3 ' Ters 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G (-> 18gsn) -3 ' Tablo 1: İleri ve Servis vektörü içine sokulmak için ORF veya Faiz Genişletici için Astarlar Ters. attB siteleri koyu harflerle vurgulanır, GSN 18'den fazla gen spesifik nükleotid primer eklenir olduğunu gösterir. Adım Sıcaklık Zaman ilk denatürasyon 94 ° C 2 dakika PCR amplifikasyon döngüsü (35) doğasını değiştirmek 94 ° C 30 sn tavlamak 55 ° C (primer Tm bağlı olarak) 30 sn uzatmak 72 ° C 1 dak / kb Ambar 4 ° C süresiz olarak Tablo 2: İlgi ORF'lerin yükseltilmesi için PCR Koşulları. Vektör İleri Sıralama Astar Ardışık ters primer mekik vektörüne 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' Tablo 3: Servis Vektör için İleri ve Geri Sıralama astarlar. İD yapı Ebeveyn destekçi Bac Res Mam Res Tet reg? pGLAP1 N dönem EGFP-TEV-S peptit pcDNA5 / FRT / TO CMV amper Hyg Evet pGLAP2 N dönem Flag-TEV-S peptit pcDNA5 / FRT / TO CMV amper Hyg Evet pGLAP3 N dönem EGFP-TEV-S peptit; C vadeli V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a amper Hyg Yok hayır pGLAP4 N dönem Flag-TEV-S peptit; ; C vadeli V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a <td> Amp Hyg Yok hayır pGLAP5 C-terminal S peptit PreProt X2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a amper Hyg Yok hayır Tablo 4: Değişken Organizatör, Epitop etiketleri ve N Dox İndüklenebilir İfade Yetenekleri veya C-terminal protein Etiketleme ile kullanılabilir LAP / TAP Vektörlerinin listesi. Vektörler ticari olarak temin edilebilir. Bac Res bakteriyel direnç işaretçisi gösterir, anne Res memeli hücre direnç işareti, Tet reg göstermektedir? sentezleme Tet / DOX düzenlenebilir olup olmadığını gösterir. Vektör İleri Sıralama Astar Ardışık ters primer pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' Tablo 5: pGLAP Vektörler için İleri ve Geri Sıralama astarlar.

Discussion

ana hatları çizilen protokol LAP etiketleme vektörüne ilgi genlerinin klonlanmasını anlatmaktadır, uyanlabilir LAP-etiketli stabil hücre çizgilerinin üretimi ve proteomik analizler için LAP-etiketli protein komplekslerinin saflaştırılması. diğer LAP / TAP etiketleme yaklaşımları ile ilgili olarak, bu protokol herhangi bir hücresel yolunun içinde protein lokalizasyonu ve protein-protein etkileşimleri haritaya yüksek verimli yaklaşımları ile uyumlu olacak şekilde aerodinamik edilmiştir. Bu ^yaklaşım, geniş bir kaç isim hücre döngüsü ilerlemesinin, mitotik iğ düzeneğinin, mil direği homeostaz ve ciliogenesis kritik proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu uygulanmış ve bu proteinlerin düzen bozukluğu insan hastalıkları ¹⁵ yol ne anlama yardımcı olmuştur ^16,19,20. Örneğin, bizim grup son zamanlarda mili montaj ^15,21 yılında STARD9 mitotik kinesin fonksiyonu ve düzenleme (bir aday kanser hedef) tanımlamak için bu sistemi kullanılan bir tanımlamaTctex1d2 dynein hafif zincir arasında yeni bir moleküler bağ ve kısa kaburga polidaktili sendromları (stres durumları) ¹⁹ ve MID2 ubikitin ligaz mutasyon X'e bağlı zihinsel engelli ¹⁶ yol açabilir nasıl anlamak için yeni bir moleküler bağlantı tanımlamak için kullanılır. Diğer laboratuvarlar de başarıyla Tctn1, fare Kirpi sinyal regülatörü, bir ciliopathy-ilişkili protein kompleksinin bir parçası olduğu belirlendi dahil olmak üzere, bu yöntemi uyguladık doku bağımlı bir şekilde ^22,23 yılında düzenlenmiş siliyer membran bileşimi ve ciliogenesis. Bu nedenle, bu protokol genel olarak herhangi bir hücresel yolunun diseksiyon uygulanabilir.

Bu protokolde kritik bir safha, Higromisin dirençli LAP-etiketli stabil hücre hatlarının seçimi. Özel dikkat kontrol plakasında tüm hücreler amplifikasyonu için deney plakasında odak seçmeden önce ölü sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Higromisin da adde edilebilirLAP-etiketli kararlı hücre hatlarının rutin hücre kültür sırasında d ayrıca tüm hücreleri FRT yerinde ilgi LAP-etiketli geni korumak sağlamak. Sizlere tüm LAP-etiketli proteinler fonksiyonel ve protein fonksiyonunu test etmek için kullanılabilir yerinde deneyleri olması önemli olduğunu dikkatli olun. Protein işlevi test etmek için kullanılan deneyler arasında örnek olarak siRNA bağlı fenotip ve in vitro aktivite deneyini kurtarma içerir. Büyük bir LAP-etiketi eklenmesi ile olası sorunları çözmek için, daha önce ilgilenilen proteinin fonksiyonunu ve lokalizasyonu inhibe az olasıdır FLAG gibi küçük etiketler, ihtiva bu sistemle uyumlu TAP-etiket vektörleri yarattı ^4. İlave olarak, sancı etiketleme vektörler C-terminali LAP-etiketli proteinler veya bir bindirme / TAP etiketi N tolere edilmediği durumlarda kullanılabilir, bu sistemde, ile uyumlu olan C-terminali TAP-etiketli proteinleri üretmek için ana kadar bir proteinin -terminus. Buna ek olarak, incisaflaştırma tamponlar (LAPX ^N) e tuzu ve deterjan konsantrasyonu artırmak veya yok ya da çok etkileşimi görülmesi halinde saflaştırma sıkılığına azaltmak için değiştirilebilir. Benzer şekilde, tandem yakınlık arıtma işlemi az veya hiç interaktörler tespit edildiğinde bu nedenle tek bir arıtma şeması kullanılabilir, kaybolmuş olabilir saflaştırma prosedürleri ve zayıf interaktörler tek daha sıkı olduğunu.

Diğer GFP epitop etiketleme yaklaşımları protein yerelleştirme ve arıtma çalışmaları ^24,25 için etiketleme büyük ölçekli GFP proteini izin vermesini var olduğunu not etmek önemlidir. Bu düzenleme elemanlarını, taklit endojen gen ifadesi ²⁴ içeren kendi doğal ortamından ilgi GFP etiketli genleri ifade etmek için bakteriyel suni kromozom kullanan BAC TransgenOmics yolla uygulanabilir. Daha yakın zamanda, CAS9 / tek destekli RNA (sgRNA) ribonükleoprotein kompleksler (RNP) son kullanılmışogenously endojen genomik lokusları ²⁵ GFP-etiketli gen ekspresyonunu sağlayan bir iki-GFP sistemi ile ilgili genleri etiketleyin. Bu yaklaşımların de burada tarif edilen LAP etiketleme protokolüne göre, endojen koşullar altında etiketli proteinlerin ekspresyonunu sağlayacak olmakla birlikte, ilgi işaretli genlerin indüklenebilir ve ayarlanabilir ifadesi için izin yoktur. Ek olarak, TAP için etiketleme ikili epitopa uygulanacak henüz. Diğer etiketleme sistemleri aynı zamanda, uyarılabilir epitop etiketli kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için burada açıklanan sistem ile uyumlu olmak için modifiye edilebileceğini not etmek önemlidir. Örneğin, yakınlık bağımlı biyotin tanımlama (BioID) nedeniyle etkileşim proteinler ²⁶ arasında mekansal ve zamansal ilişkileri tanımlamak için onun yeteneği büyük ilgi topladı. Bu teknik, Escherichia coli biyotin ligaz bira bir rasgele soyu, biotinylate protein füzyonları yararlananenzimin ~ 10 nm yarıçapı içinde herhangi bir protein s. Biyotinile proteinler daha sonra afinite biyotin-afinite yakalama kullanarak saflaştınldı ve kütle spektrometrisi ile bileşim için analiz edilmiştir. BirA kompleks ²⁷ olan zayıf etkileşim ortakları tespit edilmesi için özellikle uygun hale getirir ki, daha geçici, yakın herhangi bir protein biotinylate olacaktır. Buna ek olarak, saflaştırma şeması endojen protein-protein etkileşimleri sağlam kalır ve böylece yanlış pozitif oranını azaltır, denatüre edici koşullar altında gerçekleştirilebilir ki gerektirmez. Mevcut protokol kapsamında, bir BirA etiketleme vektör tarafından pGLAP1 vektörünün ikame yakınlık dayalı bunları tespit etmek afinite dayalı protein-protein etkileşimleri tanımlayan bu sistem dönüştürebilir. Birçok enzim-substrat etkileşimleri arasında uzaysal protein-protein inte eşleştirmek için olduğu gibi bu tür bir sistem, geçici protein etkileşimlerini tespit etmek için oldukça avantajlı olacaktırsentrozom ve kirpikler ^26,28 için gerçekleştirilmiştir olarak tanımlanan yapılar içinde kasılma konsantrasyona.

Materials

Flp-In T-REx Core Kit	Invitrogen	K6500-01	Kit for generating cell lines that contain an FRT site and TrtR expression
PETG, 5X	Nunc, Inc.	73520-734	Roller bottle for growing cells
PETG, 2.5X	Nunc, Inc.	73520-420	Roller bottle for growing cells
Cell stackers	Corning CellSTACK	3271	Cell stacker for growing cells
500 mL conical centrifuge tubes	Corning	431123	Tubes for harvesting cells
Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122	Rabbit anti GFP antibody
Affiprep Protein A beads	Biorad	156-0006	Used as a matrix for conjugating anti-GFP antibodies
Dimethylpimelimidate (DMP)	ThermoFisher Scientific	21667	Used for conjugating anti-GFP antibodies to Protein A beads
TLA100.3 tubes	Beckman	349622	Tubes for centrifuging protein lysates during the clearing step
TEV protease	Invitrogen	12575-015	Used for cleaving the GFP tag off of N-terminal LAP-tagged proteins
Precession Protease	GE Healthcare	27-0843-01	Used for cleaving the GFP tag off of C-terminal LAP-tagged proteins
S-protein agarose	Novagen	69704	Used as a second affinity matrix during the purification of LAP-tagged protein complexes
QIAquick DNA gel extraction kit	Qiagen	28704/28706	For use in purifying PCR products from an agarose gel
BP clonase II	Invitrogen	11789020	Used for cloning ORF PCR products into the pDONR221 shuttle vector
LR clonase II	Invitrogen	11791020	Used for cloning the ORF of the gene of interest into the pGLAP1 LAP-tagging vector
ccdB Survival 2 T1R E. coli	Invitrogen	A10460	Used for propgating shuttle vectors and pGLAP empty vectors
Fugene 6	Promega	E2691	Transfection reagent for transfecting vectors into human cells
Tetracycline	Invitrogen	Q100-19	Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression
Doxycycline	Clontech	631311	Drug for inducing Dox/Tet inducible protein expression
Hygromycin B	Invitrogen	10687010	Drug for selecting stable LAP-tagged integrants
Kanamycin	Corning	61-176-RG	Drug for selecting Kanamycin resistant bacterial colonies
Ampicillin	Fisher	BP1760-5	Drug for selecting Ampicillin resistant bacterial colonies
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gels	Biorad	4561094	Used for separating protein samples and final LAP-tag purification eluates
Silver Stain Plus Kit	Biorad	1610449	Used for silver staining the eluates of LAP-tagged pufications and samples collected throughout the purification process
Coomassie Blue stain	Invitrogen	LC6060	Used for staining SDS-PAGE gels to visulize LAP-tagged purifications and cutting out protein bands, mass spectrometry compatible
Shuttle vector pDONR221	Invitrogen	12536017	Shuttle vector for cloning the ORFs of genes of interest
Flippase expressing vector pOG44	Invitrogen	V600520	Vector that expresses the Flippase recombinase for integrating LAP-tagged genes into the genome of FRT site containing cell lines
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018	Used for PCR amplification of the ORFs of genes of interest
4X Laemmli sample buffer	Biorad	1610747	Sample buffer for eluting purified LAP-tagged protein complexes from the bead matrix
Luria broth (LB) media	Fisher	BP9723-2	Used for growing DH5α bacteria
DNA miniprep kit	Promega	A1222	Used for making DNA plasmid minipreps
DMEM/F12 media	Hyclone	SH30023.01	For growing Hek293 human cells
FBS lacking Tet	Altanta Biologicals	S10350	Used for making -Tet DMEM/F12 media for generating and growing inducible LAP-tagged stable cell lines
Trypsin	Hyclone	SH30042.01	For lifting Hek293 cell foci from plates
Protease inhibitor tablets	Roche	11836170001	Used for making protocol buffers, EDTA-free
10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol	Roche	11332473001	Used for making protocol buffers
PBS	Corning	21-040-CM	Used for making protocol buffers
Tween-20	Fisher	BP337-500	Used for making protocol buffers
Sodium Borate	Fisher	S249-500	Used for making protocol buffers
Boric Acid	Fisher	A78-500	Used for making protocol buffers
Ethanolamine	Calbiochem	34115	Used for making protocol buffers
NaCl	Fisher	P217-3	Used for making protocol buffers
KCl	Fisher	BP358-10	Used for making protocol buffers
Dithiothreitol (DTT)	Fisher	BP172-25	Used for making protocol buffers
MgCl2	Fisher	M33-500	Used for making protocol buffers
Tris base	Fisher	BP152-5	Used for making protocol buffers