MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.
Клинический эмбрион витрификация эволюционировали с развитием уникальных витрификационные устройств в 21 – м веке , и с неправильным представлением , что ультра-быстрое охлаждение в «открытой» системы (т.е. прямой LN 2 контакта) была необходимость оптимизации успеха витрификации. Догма окружающих важность скорости охлаждения привели к небезопасной практики , подлежащих техническому изменению и созданию витрификационные устройств , которые игнорировали важные факторы контроля качества (например, простота использования, воспроизводимости, надежности, безопасности , маркировки и безопасности хранения). Понимание контроля качества недостатки других устройств, разрешенных для разработки безопасной, надежной, повторяемые, и надежный метод мкСм-ВТФ по минимизации внутри- и меж-техник вариации. Не менее важно, что в сочетании наличие двух существующих FDA-совместимых устройств: 1) 0,3 мл Иономерный смолы эмбриона солому с интернализованной, двойного цвета, защищенные от несанкционированного вмешательства рмаркировка крыши с повторяемой уплотнением сварного шва потенциала; и 2) сокращен, широко используемый, 300 мкм ID стерильными flexipettes для непосредственной загрузки эмбриона (ов) для того, чтобы создать высоко эффективного глобального устройства витрификации. Как и другие асептические, закрытые витрификационные системы (например, с высокой степенью безопасности Витрификация (HSV), Rapid-я и VitriSafe) эффективно используется в репродуктивной медицине, microSecure Витрификация (мкСм-ВТФ) доказала , что она может добиться высокой выживаемости после потепления и беременность результаты с его вниманием к простоте, а также снижение технических вариаций. Хотя эмбрион соломы 0,3 мл, содержащий внутренний гидрофобный пробку коммерчески заменен стандартным сперме соломы, обладающей хлопковое поливинилпирролидон (PVP) пробки, она сохраняет свою Иономерный композицию смолы, чтобы обеспечить герметизацию шва. Тем не менее, ватные пробки могут фитиль из содержания жидкости эмбриона flexipettes при контакте. Модифицированный метод мкСм-VTF был адаптирован для включения дополнительного внутреннего сварного швауплотнение перед штекером на стороне загрузки устройства. Добавил технический шаг к процедуре мкСм-VTF не повлияло на его успешное применение, так как высокие показатели выживаемости (> 95%), а также показатели беременности продолжаются и сегодня.
Витрификация является единственным наиболее эффектных вспомогательных репродуктивных технологий в промышленности экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) , так как развитие интрацитоплазматической инъекции спермы. Сегодня бластоцисты замораживают без потери жизнеспособности эмбрионов , которые были связаны с традиционными методами медленного замораживания 1. С надежным выживания эмбриона после потепления, бесплодие промышленность превращается предпочтительного использования криоконсервированных циклов переноса эмбриона, которые дают аналогичные или более высокие исходы беременности, чем традиционные свежие переноса эмбриона. В связи с бластоцисты биопсии и предимплантационной генетического скрининга (PGS), витрификация стала жизненно важным клиническим инструментом для оптимизации результатов здоровых живых родов с помощью эуплоидных одного переноса эмбрионов 2, 3.
Мышиный эмбрион витрификация был разработан в середине 1980-х годов 4, </SUP> 5 и приспособленный для животных сельского хозяйства к 1990 году 6. Исходя из того, что витрификационные растворы образуют метастабильное glasseous состояние, свободное от повреждения образование кристаллов льда, оказалось более эффективно сохранить полную клеточную целостность эмбрионов. Интересно отметить , что многообещающая принятие витрификации в человеческой эмбриологии не начинал реализовываться до 21 – го века. Ранние издания , пропагандирующие использование витрификации совпало с развитием уникальных "открытых" системных устройств 7, 8, 9. Тем не менее, принятие витрификации в клиническую практику был медленным, как это произошло в тот момент, когда улучшение медленного замораживания бластоцисты также происходит. Успешное обычное замораживание медленно скорость, в дополнение к витрификации, были приведены в соответствие с улучшением систем культивирования эмбрионов, а также с состав вошлоион бластоцель сворачивания подходов, что позволило повысить как общую выживаемость трофэктодерме и, впоследствии, имплантация 10.
В последнее десятилетие, витрификация технология быстро вытеснила традиционные методы замораживания. В значительной степени это было связано с развитием специализированных устройств витрификационные. Некоторые из этих устройств имеют инвалидность общую безопасность, эффективность и эффективность клинической витрификации путем введения присущие недостатки конструкции к устройствам , используемым в IVF промышленности 11. Действительно, нюансы различных устройств вносят существенные технические различия между программами, обычно называемых "технических подписей" 12. Таким образом, научные журналы, как журнал визуализированных экспериментов (Jove), могут служить ценным ресурсом для демонстрации технических деталей, которые помогут снизить вариации исхода. Еще одна постоянная проблема в том, что Sекоторые эмбриологи продолжают дезинформировали, даже сегодня, на основе требований о том , что "ультра-быстрое охлаждение эмбрионов или ооцитов в« открытой системе витрификационным '(то есть, прямой эмбрион контакт с жидким азотом (LN 2)) является необходимым условием для оптимизации процент успеха ". Очевидно, что эта вера является неточной, основанная на проверенном успехе асептических закрытые системы 13, 14, 15.
На основе принципов криобиологические витрифицирующегося, эффективность витрификации является более значительной степени зависит от темпов потепления , чем на скорости охлаждения 16, 17, 18. В общем случае, зависит от устройства, используемого витрификации, скорость потепления должна превышать скорость охлаждения, чтобы обеспечить высокие показатели выживаемости. Высокие темпы потепления свести к минимуму возможность любого нарастания льда (т.е. Кекрystallization ядросодержащих примесей в крио-растворах) во время фазы расстекловывания потепления. Конечно, стабильность раствора витрификационным (т.е. тип и концентрацию криопротекторов используемых) , могут иметь Поразительным эффект, но это рассматривается в качестве отдельной публикации 11. Учитывая проблемы охлаждения потепления скорости, MicroSecure витрификации (мкСм-VTF) был разработан в 2008 году в качестве недорогого, некоммерческого, FDA-совместимый метод, который оптимизировал контроля качества аспекты витрификации. Он был уникален тем, что он предложил НСД-доказательство, интернализированную, двойной цветной маркировки. Кроме того, путем загрузки и хранения эмбрионов непосредственно в стерильной flexipette , используемой для пипеткой (т.е. без пипеткой на вторичной поверхности устройства) и с помощью Иономерный-смолы соломинки , которая полностью сварной уплотнение с использованием автоматизированного герметиком, техническое изменение было фактически устранено.
При оценке грompleteness витрифицирующегося устройств для возможного использования, существует несколько факторов контроля качества , которые должны быть приняты во внимание, в том числе: 1) обозначая потенциальные -Может этикетки быть надежно привязаны? Являются ли они устойчивости к внешним воздействиям? Они предлагают двухцветными идентификационный потенциал? Требует ли это вторичный ярлык, и может этикетка легко снимается для целей учета (т.е. пациента проверка) после потепления? 2) Техническая простота -Может эмбрионы быть легко загружены в / на устройство своевременно и просто идентифицировать и проследить пост-потепление? 3) Процедурный простота / Повторяемость -Does метод витрификации предложение простоту и надежность , что позволяет легко для воспроизводимости, что сводит к минимуму различия между техниками (внутренних) и программ (внешние)? 4) LN 2 емкость запоминающего устройства -Can устройства легко и безопасно обработаны и идентифицированы? Является ли их STOбушевать потенциальное пространство эффективно? Имеет ли устройство обеспечить безопасность и безопасность от физического повреждения или возможных загрязнителей в качестве асептической замкнутой системы? 5) потенциал восстановления / живучести -Это дизайн устройства склонны к потенциальным проблемам гарантированного восстановления эмбрионов, и они будут надежно остекловывать и поддерживать полную клеточную целостность после новоселье? Последнее качество конкретных озабоченность, скорость восстановления, на самом деле было неожиданно сведено к минимуму в опубликованных отчетах; это делается как правило , скрывается неблагоприятный исход (т.е. потерянная эмбриона или яйцо) в типично хорошие показатели выживаемости. Любое устройство, склонным к несовместимым восстановления (<99%) серьезно испорчено и представляет собой процессуальную ответственность.
Наш асептический, закрытый метод мкСм-VTF был стратегически разработан для учета каждой меры контроля качества. Тем не менее, после 5 лет высшего клинического успеха и проверки 14, процедура была тO быть изменен. Исходные 0,3 мл эмбрион соломки (обладающих гидрофобной штекером) были удалены из IVF промышленности и заменен на 0,3-мл семенной жидкости соломы , обладающей стандартный хлопок / PVP пробки (т.е. перемаркированные в качестве семенной жидкости / эмбрионов соломы). Это процедурное документе излагаются конкретные шаги и стратегии, необходимые для безопасного, просто и эффективно осуществлять мкСм-VTF. Кроме того, мы не выделили модификации (ы), необходимые для надежного учета ограничений поставок, до тех пор, как альтернативный идеальный контейнер соломы вновь вводится обратно в клинической лаборатории.
На сегодняшний день существует высокая ожидание достижения полной выживаемости бластоцисты (> 95%) и достижение успеха имплантации, аналогичную свежих эмбрионов. Некоторые группы предполагают, что живые рождаемости витрифицированных циклов переноса эмбрионов, возможно, даже выше, чем свежие бластоцисты, когда неповрежденными криоконсервации эмбрионов пересаживают в здоровую, не-гормонально-стимулированной матки. Наши данные четко показывают, что стеклование эффективно и надежно сохраняет жизнеспособность свежего эмбриона. Кроме того, мы показали , что наша асептическая, закрытый метод, называемый MicroSecure витрификации (мкСм-ПТФ), можно достичь оптимального результата , сравнимой или большей , чем коммерческие стандарты (т.е. открытые системы устройств) , используемых в промышленности IVF.
Вариация связан с технической воспроизводимости и надежности между отдельными лицами с использованием множества витрификационные устройств / методов. В свою очередь, это привело к inconsistencies между программами, применяющих витрификации. Поэтому не удивительно, что устройство фамильярность является важным фактором в отношении лабораторного профессионализма и успешных результатов. Именно эта концепция «технической подписи» 11 , что объясняет , почему воспроизводимости между программами может быть проблематичным. Мало того, что развитие более десятка коммерческих устройств осложненный это явление, оно создало проблемы контроля качества. К счастью, закрытые системы стекловании как мкСм-VTF, Rapid-I, и VitriSafe, теперь оказывается столь же эффективным для открытых систем устройств 12, 13, 14.
MicroSecure ВТФ является новым, асептики витрификация разработана с технической простотой, надежностью и крио-безопасности в виду. Комбинируя использование двух ранее утвержденных, FDA-совместимых устройств, это некоммерческий система витрификация шIth явное преимущество иметь установленную низкую стоимость, в отличие от специализированных устройств. Кроме того, его уникальный неумелого и усвоены Двухцветные систему маркировки, а также многочисленные другие преимущества контроля качества, сделали мкСм-VTF привлекательным глобальным параметром 11. В качестве некоммерческого устройства ВТФ, однако его широкое применение промышленности развивается медленно. Только через продолжение публикации своей безопасности, безопасности и клинической эффективности получат мкСм-ВТФ растущее использование.
В августе 2014 года, столкнувшись с невозможностью приобрести оригинальную 0,3 мл эмбриональной соломы, изготовленного с внутренним, без затекания гидрофобного пробки, мы смогли достоверно изменить метод мкСм-VTF. Короче говоря, новые 0,3 мл спермы / эмбрионов соломки с их ватно-PVP пробками были эффективно адаптированы. Это просто достигается за счет создания внутреннего уплотнения перед ватным тампоном, таким образом предотвращая контакт и жидкость впитывания соткрытого состава ПТФ наконечник (т.е. flexipette , содержащий эмбрион или яйца). Кроме того, если 40-мм ID стержни не доступны, вопрос, связанный с плавучестью легких 30-мм стержней может быть противовесом с помощью двух шарикоподшипниках.
Эти дополнительные шаги сделаны метод немного менее простой, но все же весьма эффективно. Сегодня, экономика и эффективность становятся все более важные проблемы, так как биопсию бластоцисты, как правило, остекловано индивидуально, пока их статус не euploidy подтвержден на докладе генетики. Бластоцисты с подтвержденным нежизнеспособных анеуплоидии статусом, как правило, выбрасываются, с согласия пациента, в течение нескольких недель. Таким образом, большинство (> 50%) VTF устройств отбрасываются после кратковременного хранения, в результате чего эскалацию ежегодные затраты при использовании коммерческих устройств. В целом, мкСм-ВТФ является весьма эффективным, надежным и повторяемым процедура криоконсервации человеческих бластоцист. Превосходное качество-контроль дизайн securelу метки и безопасно хранит / эмбрионов ооциты, устраняя сбой восстановления и оптимизации выживаемости после потепления и жизнеспособность, что оправдывает использование системы в качестве универсального подхода к эмбриональной витрификации.
The authors have nothing to disclose.
MC Schiewe хотел бы поблагодарить г-Форест Гарнер в Fertility Center в Лас-Вегасе за его статистической экспертизы при анализе и оценке годовых данных CDC и SART. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить их медицинский директор, д-р Роберт Э. Андерсон, за его самоотверженную поддержку и веру в наших технических способностей и знаний.
Aluminum Cane | IVM | XC055 | ||||
Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel | |||
CBS semen/embryo straw, 0.3ml | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile | |||
Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted | |||
Culture tubes, 15ml | Falcon | 352099 | Conical | |||
Culture tubes, 10ml | Falcon | 352057 | Snap-cap | |||
Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | ||||
Filter, 250ml | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm | |||
Flasks, Tissue Culture 50ml | Falcon | 353014 | ||||
Flexipettes, 300μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack | |||
Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | ||||
Forcep,Splinter – fine | Miltex | 17-305 | ||||
Goblet | IVM | PA003 | ||||
Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110V or 220V with adapter | |||
Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100ml | with non-essential AA's | ||||
Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors | |||
Liquid Nitrogen Tank, 40L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage | |||
LN2 Dewar flask, 0.5L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel | |||
6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case | |||
Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex | |||
Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351006 | ||||
Petri Dishes, 58mm | Nunc | 150288 | ||||
Petri Dishes, 100mm | Falcon | 351029 | ||||
Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10-100μl | |||
Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable | |||
Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | ||||
Pipettes, Serological 1ml | Falcon | 357521 | ||||
Pipettes, Serological 2ml | Falcon | 357507 | ||||
Pipettes, Serological 5ml | Falcon | 357543 | ||||
Pipettes, Serological 10ml | Falcon | 357551 | ||||
Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | ||||
Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | ||||
Sterile Gauze pads, 4"x4" | Kendall Healthcare | 6939 | ||||
Synthetic serum | Life Global or | LGPS-20 ; 20ml, or | stored at 2-8ºC | |||
Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10ml | purchase low endotoxin lot | ||||
Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50ml flasks, 1year | |||
17.1g/flask +Medium to 50ml | ||||||
makes a 1M solution | ||||||
Filter with 0.22µm unit | ||||||
Timer | Nalgene | 5016-001 | ||||
Thawing Solution | Innovative | BL-TS | T1, T2, T3, T4 | |||
Cryo Enterprises | (≤1.0M Sucrose) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
Vitrification Solution*,** | Innovative | BL-VS | V1, V2, V3 | |||
Cryo Enterprises | (≥7.9M [Glycerol/EG]) | stored at 2-8ºC for ≤1 month after opening | ||||
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | ||||||
** other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. |