Conception et mise en œuvre d'un Illuminating automatisé, la culture, et du système d'échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications
Summary
Nous avons conçu un appareil de culture en continu destiné à être utilisé avec des systèmes optogénétiques pour éclairer les cultures de micro-organismes et cellules d'image régulièrement dans l'effluent avec un microscope inversé. La culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'images sont entièrement automatisées afin que les réponses dynamiques à l'éclairage peuvent être mesurés sur plusieurs jours.
Abstract
systèmes optogénétiques utilisent des protéines génétiquement codés qui changent de conformation en réponse à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière pour modifier les processus cellulaires. Il existe un besoin pour la culture et la mesure de systèmes comprenant un éclairage programmé et la stimulation des systèmes optogénétiques. Nous présentons un protocole pour la construction et l'utilisation d'un appareil de culture en continu pour éclairer des cellules microbiennes avec des doses programmées de lumière, et automatiquement d'acquérir et analyser des images de cellules dans l'effluent. Le fonctionnement de cet appareil permet chémostat le taux de croissance et l'environnement cellulaire à être étroitement contrôlés. L'effluent de la culture cellulaire continue est régulièrement prélevé et les cellules sont imagées par microscopie à canaux multiples. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que les réponses dynamiques de l'intensité de fluorescence et de la morphologie cellulaire des cellules prélevées à partir de l'effluent de la culture sont mesurés sur plusieurs jourssans intervention de l'utilisateur. Nous démontrons l'utilité de cet appareil de culture en induisant de façon dynamique la production de protéines dans une souche de Saccharomyces cerevisiae conçu avec un système de optogenetic qui active la transcription.
Introduction
Systèmes optogénétiques utilisent la lumière pour contrôler une liste croissante des processus cellulaires , y compris l' expression des gènes, 1, 2, 3, 4, 5 localisation des protéines, l' activité 6 de protéines, 6, 7, liaison 8 protéines, 8, 9, 10 et la dégradation des protéines. 11 Un procédé de culture de cellules dans un environnement contrôlé avec une stimulation optique programmée et pour mesurer leur réponse sur des périodes biologiquement pertinentes est nécessaire pour exploiter le potentiel de ces outils pour la recherche en biologie cellulaire et la biotechnologie. Notre procédé met à profit chemostasis pour maintenir un taux de croissance de la constante de cellule dans un endroit bien mélangé, aenominale, et le récipient de culture en verre à température contrôlée 12, 13 qui est exposé à un éclairage programmé. Nous, l'image cellules individuelles dans l'effluent de la culture avec un microscope inversé pour mesurer la réponse de la culture à un éclairage programmé. La mise en culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'image sont entièrement automatisées de sorte que l'intensité de la fluorescence et de la morphologie cellulaire de la culture cellulaire des effluents peuvent être mesurés sur plusieurs jours sans intervention de l'utilisateur.
Ce protocole peut être mis en oeuvre dans la plupart des laboratoires familiers avec la culture et la microscopie de cellules en croissance, et l'appareil utilisé est peu coûteux et constitué de composants facilement disponibles. Un récipient de culture transparente est placée au- dessus d' une matrice de diodes électroluminescentes (DEL) capables d'émettre une uW / cm 2 à 10 mW / cm2 de lumière. Les microbes sont cultivées dans un récipient de culture en continu; une pompe péristaltique est utilisée pour ajouter des médias à lataux de dilution, un autre sert à retirer la culture à un taux inférieur au microscope, et la différence sort par une sortie de trop-plein. Un coussin chauffant pour maintenir la température. De l'air est continuellement pompée dans le récipient de culture pour maintenir une pression positive, ainsi que pour mélanger et oxygéner la culture. À l'exception de la pompe à air, l'alimentation de ces dispositifs est régulée par un microcontrôleur qui reçoit également une entrée d'un thermomètre et d'un ordinateur connecté. La culture cellulaire effluent est pompé vers un dispositif microfluidique sur la platine d'un microscope inversé. Non-fluorescent et images fluorescentes sont automatiquement acquises. Les cellules dans les images sont caractérisées par un algorithme qui permet de localiser chaque cellule en tant que région d'intérêt (ROI) et mesure les propriétés de chaque ROI.
Pour démontrer une application de ce protocole, nous avons mesuré la réponse à différentes intensités lumineuses des cellules Saccharomyces cerevisiae modifiées avec une responsa lumière bleueve optogenetic système qui contrôle la transcription de la protéine fluorescente. S. cerevisiae, communément connu sous le nom de levure de boulanger, a été choisi parce que plusieurs systèmes optogénétiques pour contrôler l' expression génique dans ce système il existe déjà 14, 15, 16. En outre, cet organisme modèle est couramment utilisé pour les études de la biologie des systèmes 17 et en tant que châssis pour des applications biotechnologiques 18, 19, 20. Les résultats représentatifs montrent que ce protocole peut être utilisé pour contrôler la transcription d'une culture pendant plusieurs jours en faisant varier les intensités lumineuses d'entrée et en mesurant la production d'un rapporteur fluorescent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons conçu cet appareil avec une flexibilité à l'esprit. Tout le code utilisé est gratuit et open-source. Le processus d'analyse d'image par défaut pour les cellules de segment est simple et fonctionne rapidement. Analyse personnalisée pourrait être mis en œuvre par l'enregistrement d'entrée de l'utilisateur lors de l'analyse d'une image représentative de l'interface utilisateur graphique FIDJI, convertir l'entrée d'un script beanshell, puis définir le plugin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Molly Lazar et Verónica Delgado aide pour tester le protocole, Kieran Sweeney pour des discussions utiles et l'édition, et Taylor Scott, My An-adirekkun, et Stephanie Geller pour la lecture critique du manuscrit. Megan Nicole McClean, Ph.D. est titulaire d'une bourse de carrière à l'interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
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