미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현
Summary
우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.
Abstract
Optogenetic 시스템은 세포 과정을 변경하는 빛의 특정 파장에 대한 응답으로 형태를 변경 유전자 인코딩 된 단백질을 사용한다. optogenetic 조명 시스템의 프로그래밍 및 자극을 탑재 되 배양 시스템 및 측정이 필요하다. 우리 구축 광의 프로그래밍 용량과 균체를 조명하고, 자동으로 획득하고 유출 셀의 이미지를 분석하는 연속 배양 장치를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. chemostat 등이 장치의 동작은 성장 속도와 셀룰러 환경이 엄격하게 제어 될 수있다. 연속 세포 배양의 유출 물을 주기적으로 샘플링하고, 세포를 다 채널 현미경으로 이미지화된다. 형광 강도 배양 유출 물로부터 샘플링 된 세포의 세포 형태의 동적 응답이 여러 날에 걸쳐 측정되도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전히 자동화사용자 입력없이. 우리가 동적으로 전사를 활성화 optogenetic 시스템 설계 사카 세레 비지에 균주에서 단백질 생산을 유도하여 배양 장치의 유용성을 입증한다.
Introduction
Optogenetic 시스템은 유전자 발현, 1, 2, 3, 4, 5 단백질 지역화 육 단백질 활성, 6, 7, 8, 단백질 결합, 8, 9, 10, 단백질 분해 등의 세포 과정의 성장 목록을 제어하는 광을 사용한다. 프로그래밍 광 자극으로 제어 된 환경에서 세포를 배양하고, 생물학적으로 중요한 시간 척도에 걸쳐 반응을 측정하기위한 방법 (11)은 세포 생물학 및 생명 공학 연구를 위해 이러한 도구의 전위를 이용하는 것이 필요하다. 우리의 방법은, AE, 잘 혼합에 일정한 세포의 성장 속도를 유지하기 chemostasis 활용평가 및 프로그램 조명에 노출되는 온도 조절 유리 배양 용기 (12, 13). 역 현미경 배양 유출 화상에서는 개별 셀이 프로그래밍 된 조명에 문화의 반응을 측정한다. 형광 강도 및 유출 세포 배양의 세포 형태는 사용자의 입력없이 여러 날에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 이미지, 이미지 분석은 완전 자동화된다.
이 프로토콜은 성장하는 세포 배양과 현미경 익숙한 대부분 실험실에서 구현 될 수 있으며, 사용되는 장치는, 저렴하고 용이하게 가능한 구성 요소했다. 투명 배양 용기 광의 1 μW / cm 2 mW의 -10 / cm이 발광 가능한 발광 다이오드 (LED)의 행렬 위에 배치된다. 미생물 연속 배양 용기에서 성장된다; 하나의 연동 펌프는에 미디어를 추가하는 데 사용됩니다희석 비율은 다른들은 현미경 낮은 속도로 배양을 인출하는 데 사용되며, 그 차이는 오버 플로우 출구를 통해 빠져. 가열 패드 온도를 유지합니다. 공기는 연속적으로 양압을 유지할뿐만 아니라, 혼합 배양을 통기 배양 용기에 펌핑된다. 공기 펌프를 제외하고,이 장치의 전원은 온도계와 연결된 데스크탑 컴퓨터로부터 입력을 수신하는 마이크로 컴퓨터에 의해 조절된다. 유출 세포 배양은 거꾸로 현미경의 무대에서 미세 유체 장치로 펌핑된다. 비 형광 및 형광 이미지가 자동으로됩니다. 이미지 내의 셀은 ROI (region of interest)를 각 셀의 위치를 각 ROI의 특성을 측정하는 알고리즘을 특징으로한다.
이 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 푸른 빛 responsi으로 설계 사카로 마이 세스 세레 비지 세포의 변화하는 빛의 강도에 대한 응답을 측정형광 단백질의 전사를 제어하는 시스템 optogenetic했습니다. 이 시스템에서 유전자 발현을 제어하기위한 여러 optogenetic 시스템이 이미 14, 15, 16가 존재하기 때문에 통상적으로 빵 효모 S. cerevisiae의 알려진이 선택되었다. 또한,이 모델 생물은 일반적으로 시스템 생물학 (17)과 생명 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20 섀시로 연구에 사용됩니다. 우리의 대표적인 결과가이 프로토콜은 입력 광 강도를 변화 형광 리포터의 생산을 측정함으로써 복수 일 배양의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
Protocol
그림 1 : 연속 배양 장치. 이 개략도는 상기 장치는 조명, 배양에 사용하는 경우 조립 및 미생물의 광학 특성을 측정되어야하는지 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <p class="jove_content" fo:keep-together.wit…
Representative Results
이 장치는 CRY2 / CIB1 단백질 쌍 (30)에 기초하여 유도 optogenetic 전사 시스템을 통해 푸른 빛의 질문에 답변 노란색 형광 단백질 (YFP)를 표현하는 S. cerevisiae의 문화를 자극하기 위해 사용되었다. 세포를 0.2 ± 0.008 평균 희석 속도 포스페이트 한정 배지에서 배양 하였다 chemostatically. 인산 제한은 일반적으로 성장 속도를 제어하는 S. 세레 비지 chemo…
Discussion
우리는 마음의 유연성이 장치를 설계했습니다. 사용 된 모든 코드는 무료이며 오픈 소스입니다. 세그먼트 셀 기본 이미지 분석 과정은 간단하고 신속하게 실행. 사용자 분석, 피지 그래픽 유저 인터페이스로 대표 화상을 분석하는으로 Beanshell 스크립트 입력을 변환하고 스크립트를 호출하는 플러그인을 설정하는 동안 사용자 입력을 기록함으로써 구현 될 수있다. 이 호출 될 때,이 스크립트는 배?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론과 편집을위한 프로토콜, 키 에런 스위니 테스트에 도움이 몰리 라자 베로니카 델가도를 인정, 그리고 원고의 중요한 읽기 테일러 스콧, 내 한 – adirekkun, 그리고 스테파니 겔러 것이다. 메건 니콜 소매점을, 박사 버로우즈 웰컴 기금에서 과학 인터페이스에서 경력 상을 보유하고있다.
Materials
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
References
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Citer Cet Article
Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications. J. Vis. Exp. (120), e54894, doi:10.3791/54894 (2017).