Denne undersøgelse beskriver en imaging-baserede mikro-neutraliseringsanalyse at analysere de antigene relationer mellem vira. Protokollen anvender en flatbed scanner og har fire trin, herunder titrering, titrering kvantificering, neutralisering, og neutralisering kvantificering. Assayet fungerer godt med nuværende cirkulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus.
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Micro-neutralisering (MN) assays anvendes i virologi til kvantificering af neutraliserende antistoffer og antivirale aktiviteter. Som et alternativ af hæmagglutinationsinhiberings (HI) assays, MN assays kan overvinde ikke-antigene virkninger påvirket af affinitets ændringer i receptor-bindende i influenzavira, som kan komplicere fortolkningen af HI resultater 1,2,3. Indtil for nylig blev de fleste MN assays baseret på cytopatiske virkninger (CPE) eller enzymkoblet immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN assays baseret på reduktion fokus og plak blev udviklet i 1990 6,7,8. Plakanalyser reduktion afhængige tælle synlige plaque at kvantificere infektivitet. Imidlertid visuelle tællinger kun dække store plaques, der er løses ved menneskeøjne, selv om de fleste af plaques er små og usynlige for mange nuværende cirkulerende virus. Denne ufuldstændig dækning kan forårsage betydelig variation blandt eksaminatorer og mellem eksperimenter, der fører til jegncomparable resultater. Det er også umuligt at anvende den metode, når visse vira viser abortiv infektion af enkeltceller eller meget små plaques.
De fattige optælling opløsning kan forbedres ved at indføre en imaging-baseret protokol. Med teknologiske fremskridt, optisk mikroskopi og high-throughput godt plade læsere kan give nøjagtige midler til at tælle de inficerede celler 9. Under en trans-belyst mikroskop, kan inficerede celler tagget med bestemte markører visualiseres ved deres absorption eller fluorescens kontrast i sub-cellulær opløsning. En prøve kan derefter analyseres på en computerskærm.
Desværre, på grund af begrænsningen i synsfeltet, er mere end hundrede flisebelagte billeder forpligtet til at dække en enkelt brønd. Analysere en plade med 96 brønde ville kræve billeddannelse og behandling af omkring ti tusinde billeder. En sådan omstændelig proces er tidskrævende og dyrt, og beslutningen indhøstet er under slægternel unødvendig til rutinemæssig karakterisering af virusinfektioner. Laboratorier med et begrænset budget kan opleve, at den tilgang, bygget op omkring en flatbed scanner giver en omkostningseffektiv, high-throughput alternativ.
I denne artikel beskriver vi en forbedret plakreduktion MN assay, der er egnet til den antigene karakterisering af et stort antal virusser og til kvantitativ måling antivirale aktiviteter og neutralisering antistoffer. Assayet har flere fordele: for det første er et billeddannende assay der er i stand til at måle virusinfektioner på celleniveau, uanset plaquestørrelse. Tælle det samlede inficerede cellepopulation (ICP) i en brønd i høj grad øger påvisningen følsomhed, hvilket gør det muligt at karakterisere de vira med lav infektivitet. For det andet er en mere nøjagtig kvantitativ titrering indført før neutralisering at bestemme mængden af input-virus. Den kvantitative input virus reducerer varia betydeligttion mellem forskellige eksperimenter og gør resultaterne mere sammenlignelige mellem laboratorier. For det tredje kan neutralisationstitere bestemmes direkte ved analyse af billeder, hvilket gør kvantificering hurtig og brugervenlig. Endelig protokol giver en omkostningseffektiv og high-throughput alternativ med den krævede opløsning og nøjagtighed. Kvantificeringen er baseret på en flatbed scanner og fri databehandling software. Hele opsætningen har et lille fodaftryk og er deployerbare i de fleste laboratorier.
Protokollen i dette papir består af fire store skridt, herunder virus titrering, titrering kvantificering, virus neutralisering, og neutralisering kvantificering. Virustitrering er et præparat eksperiment, der bestemmer mængden af input-virus, der skal anvendes i neutralisering. Under en titrering, er et antal af virale koncentrationer anvendes på cellemonolag i en plade med 96 brønde. De inficerede celler derefter kvantificeres i afsnit 2. Den virale Dilution, der producerer 20% -85% ICP er til gengæld anvendes som input virus til den tilsvarende neutralisering i § 3. titre af neutralisering protokollen kvantificeres ved hjælp sektion 4. Eksperimenter, der fulgte de ovennævnte protokoller er præsenteret i de Repræsentative resultater. Assayet er blevet testet grundigt i de sidste to år med de fleste af de nuværende cirkulerende influenzavira, såsom A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus. Resultaterne af influenzavirus karakterisering blev inkluderet i rapporterne for samrådet WHO, der gav anbefalinger om influenzavacciner til brug på den sydlige halvkugle i 2016 og den nordlige halvkugle i 2016-2017.
I denne undersøgelse beskrev vi et billeddannende-baserede MN assay til at kvantificere de sande antigene relationer mellem vira. Sammenlignet med andre assays plaque-reduktion, understreger fremgangsmåden måling af ICP af en hel brønd, sikrer fuldstændig dækning af den infektiøse befolkning. Uafhængigheden af plakdannelse udvider også anvendelsen af assayet for virus, der kan danne hovedsageligt usynlige små plaques eller som kun håndtere encellede infektion. Derfor er assayet stand til at undersøge flere vira og virkningerne af en bredere vifte af antistoffer end HI, og det bidrager til mere omfattende afspejle de antigene ligheder eller forskelle mellem vira 12. For eksempel når oseltamivircarboxylat er inkluderet, MN assayet er mindre påvirket af NA-afhængig binding, hvilket afspejler de antigene forskelle mere nøjagtigt. Under udviklingen af assayet blev gjort en stor indsats for at forbedre eksperimentet konsistens, hastighed og detektionfølsomhed, herunder ved at kontrollere input virus gennem kvantificeres titrering, billedbehandling i høj kapacitet med en flatbed scanner, og gennemføre en brugervenlig databehandling platform. Resultaterne har generelt været i overensstemmelse med og bekræftet dem i HI. Især resultaterne afslørede også antigene forskelle mellem antigen drift varianter af nylige type A og B vaccine virus, samt antigene ændringer forårsaget af kultur-udvalgte eller sporadiske ændringer, såsom den G155E substitution i HA1 af visse A (H1N1) pdm09 vira 12.
Protokollen matchede virus type eller undertype med udvælgelsen af cellelinier, der gav den stærkeste infektion, hvilket i høj grad forbedret billeddannelse signal. Eksperimentel variation blev glattet med design af dubletter, som afbalanceret med antallet af testede antisera. Usikkerheder kan også komme fra billedkvaliteten, som hovedsageligt påvirket af imaging enhed. En anstændig farve flatbed scanner kan signideligt forbedre billedets kontrast og reducere støjen. Mængden af input virus i neutralisering skal bestemmes kvantitativt på forhånd fra den tilsvarende titrering, mens vira stadig bevare en lignende status. Under neutralisation, antiserummet reaktion på en infektion er normaliseret mod forskellen mellem reference-virus (VC) og baggrundsniveauet (CC). Nøjagtige målinger af VC og CC er væsentlige for en neutralisering eksperiment. Flere dubletter anbefales (otte dubletter blev brugt i de Repræsentative resultater). Endelig forstå software er afgørende for succes af et eksperiment. Den software er blevet testet til rutinemæssig viruskarakterisering i WHO Influenza Center, UK i mere end to år. Detaljerede instruktioner til håndtering af forskellige situationer findes i den supplerende S1.
Denne MN assay er velegnet til applikationer, hvor prøverne dækker en extremely store synsfelt, men kræver kun moderat imaging opløsning. De lave omkostninger og enkel opsætning gør systemet let tilgængelige for de fleste virologiske laboratorier. Variationen i målinger af den samme prøve var mindre end 3%, hvilket stort set definerer usikkerhed indført under scanningen 11. Sådan reproducerbarhed er tilstrækkelig i mange virologiske undersøgelser og kan reduceres yderligere ved at midle billeder fra flere scanninger.
Afslutningsvis denne undersøgelse viser en robust MN assay, der kan rutinemæssigt anvendes i antigen undersøgelse og støtte HI data i detaljerede analyser af aktuelt cirkulerende influenzavira, især for den halvårlige udvælgelse af virus til optagelse i humaninfluenzavacciner.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
Trypsin | Sigma | T1426 | |
Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |