Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal
Summary
Este protocolo describe cómo preparar una matriz mixta 2D, que consta de gelatina y colágeno I, y un colágeno 3D para estudiar invadosomas lineales. Estos protocolos permiten el estudio de la formación invadosoma lineal, la actividad de degradación de la matriz, y la capacidad de invasión de células primarias y líneas celulares de cáncer.
Abstract
La adhesión celular, la migración y la invasión están implicadas en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Por ejemplo, durante la formación de metástasis, las células tumorales tienen que cruzar barreras anatómicas para invadir y migrar a través del tejido circundante para llegar a los vasos sanguíneos o linfáticos. Esto requiere la interacción entre las células y la matriz extracelular (ECM). A nivel celular, muchas células, incluyendo la mayoría de las células cancerosas, son capaces de formar invadosomas, que son estructuras basadas en actina F capaces de degradar ECM. Los invadosomes son estructuras de actina protrusivas que reclutan y activan las metaloproteinasas de matriz (MMPs). La composición molecular, la densidad, la organización y la rigidez de la ECM son cruciales en la regulación de la formación y la activación invadosoma. In vitro , un ensayo de gelatina es el ensayo estándar usado para observar y cuantificar la actividad de degradación invadosoma. Sin embargo, la gelatina, que es colágeno desnaturalizado I, no es una matriz fisiológica eLement. Se desarrolló un nuevo ensayo utilizando fibrillas de colágeno tipo I y se utilizó para demostrar que esta matriz fisiológica es un potente inductor de invadosomas. Los invadosomas que se forman a lo largo de las fibrillas de colágeno se conocen como invadosomas lineales debido a su organización lineal en las fibras. Además, el análisis molecular de invadosomas lineales mostró que el receptor de dominio de discoidina 1 (DDR1) es el receptor implicado en su formación. Estos datos demuestran claramente la importancia de utilizar una matriz fisiológicamente relevante para comprender las complejas interacciones entre las células y la ECM.
Introduction
La remodelación de la matriz extracelular (ECM) se produce durante procesos fisiológicos y patológicos, como la angiogénesis y la invasión de células tumorales. En condiciones fisiológicas, muchos tipos de células, en su mayoría procedentes del linaje hematopoyético, son capaces de degradar elementos ECM. Por ejemplo, los macrófagos son capaces de cruzar las barreras anatómicas para llegar a los tejidos, y los osteoclastos degradan la matriz ósea para asegurar la homeostasis del calcio. Más globalmente, todas las matrices en el cuerpo se renuevan para mantener sus propiedades físicas y químicas. En los tejidos de cáncer, la composición del microambiente tumoral está alterada. Por ejemplo, en cáncer de mama y pulmón, el colágeno tipo I se sobreexpresa y se acumula alrededor del tumor. Además, esta acumulación se asocia con un mayor riesgo de desarrollar metástasis 1 , 2 . Las metástasis del cáncer dependen de la capacidad de las células cancerosas para degradar la ECM e invadir tejidos adyacentes.
losInvasiva de las células se atribuye a las estructuras especializadas ricas en actina conocido como invadosomes. Este término incluye podosomas e invadopodia, que están presentes, respectivamente, en células normales y de cáncer ( por ejemplo, macrófagos, células endoteliales y células cancerosas, como la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231). In vitro , los invadosomes pueden organizarse en diferentes formas: puntos, agregados o rosetas 3 . Clásicamente, los invadosomas se componen de un núcleo de F-actina que contiene varias proteínas, como la proteína de andamio Tks5 y la cortactina, rodeadas por moléculas de placa de adhesión, tales como integrinas y vinculina 4 . Recientemente, se demostró que Tks5 y RhoGTPase Cdc42 se puede utilizar como una firma molecular mínima para invadosomes funcionales [ 5] . Estas estructuras son capaces de degradar la ECM mediante el reclutamiento y la activación de proteínas metaloproteasas específicas, como MT1-MMP y MMP-2 6. En un estudio anterior, se informó de que la interacción entre las fibrillas de colágeno tipo I y el receptor de dominio de la discoidina 1 (DDR1), un receptor específico de fibrillas de colágeno tipo I, conduce a la formación de una nueva clase de invadosomes, llamados invadosomes lineales. Lineales invadosomas se forman a lo largo de tipo I fibrillas de colágeno [ 7] . Estas estructuras son capaces de degradar las fibrillas de colágeno tipo I mediante el reclutamiento y la activación de MT1-MMP / MMP2. Además, su formación depende de Tks5 y Cdc42 5 . In vitro , se demostró la existencia de invadosomas lineales y la implicación de DDR1 en su formación y actividad 8 utilizando diferentes estrategias consistentes en una combinación de diversos elementos de matriz, incluyendo: i) cubreobjetos fluorescentes revestidos con gelatina, ii) fibrilos de colágeno tipo I fluorescente Cubreobjetos, y iii) tapones de colágeno tipo I en 3D. Debido al uso de diferentes matrices, pudimos estudiar y caracterizarIze la formación invadosoma lineal y su actividad de degradación 7 , 8 .
Por último, para comprender mejor la biología de las células invasivas, se utilizó una combinación de componentes ECM en sistemas de cultivo 2D y 3D, imitando la complejidad de la composición microambiental tumoral. A continuación se presentan protocolos para el recubrimiento de cubreobjetos con gelatina / colágeno tipo I en sistemas de cultivo 2D y 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Clásicamente, los invadosomes se estudian in vitro sin tener en cuenta el microambiente y la matriz en la que se cubren las células. Actualmente se utilizan varios tipos de matrices, incluyendo gelatina, fibronectina, vitronectina o colágeno fibrilar de alta densidad (HDFC) 7 , 11 ; Sin embargo, a menudo no son representativos del microambiente en el que residen las células y no son fisiológicamente relevantes. Aquí, un nuevo tipo de matriz, que c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM recibió el apoyo de una beca de doctorado del INSERM / Région Aquitaine y ahora cuenta con el apoyo de una beca post-doctoral ARC y el Tisch Cancer Institute de la Escuela de Medicina Mount Sinai. EH cuenta con el apoyo de un doctorado del Ministerio de Enseñanza Superior y de la Investigación. ZE cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral de la Agencia Nacional de Investigación (ANR). CM está apoyado por el Instituto Tisch Cancer en la Escuela de Medicina Mount Sinai y JJBC es apoyado por el NIH / NCI subvención K22CA196750, el TCI Young Científico Cáncer Research Award JJR Fondo y el Tisch Cancer Institute en Mount Sinai School of Medicine. Este trabajo fue apoyado por una subvención de ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS es apoyado por la "Ligue nationale contre le cancer". VM y FS son apoyados con fondos de "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" y el Instituto Nacional del Cáncer, INCA_8036 y PLBio2012.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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