这里我们介绍(一)鉴定抗菌活性的天然产物的,(B)化合物的净化,(C),其生物合成的第一种模式,(D)的基因组测序/ -mining和详细协议( E)的生物合成基因簇的验证。
链霉菌菌株是众所周知的,以产生大量的具有各种生物活性的不同化合物的能力。在不同条件下培养往往导致产生新的化合物。因此,该菌株的生产培养物,用乙酸乙酯萃取,粗提取物通过HPLC进行分析。此外,提取物用于通过不同测定其生物活性进行测试。对于结构鉴定感兴趣的化合物是由不同层析方法的组合进行纯化。
加上基因组采矿基因组测序允许使用不同的计算机程序的天然产物的生物合成基因簇的鉴定。以确认正确的基因簇已被鉴定,基因失活实验必须执行。所得的突变体进行了分析用于生产特定的天然产物。一旦正确的基因簇已被灭活,该应变应失败,以产生化合物。
工作流程显示为链霉菌diastatochromogenesTü6028生产的抗菌化合物,polyketomycin。大约十年前,当基因组测序仍然是非常昂贵的,一个基因簇的克隆和鉴定是一个非常耗时的过程。快速的基因组测序基因组与联合开采加速了群识别的试验和开辟了新的方法来探索生物合成,并产生新的天然产品通过遗传学方法。本文中所描述的协议可以被分配到从链霉菌属菌株或其他微生物产生的任何其他化合物。
从植物和微生物天然产物一直用于临床药物开发和研究的一个重要来源。第一种抗生素青霉素是由亚历山大·弗莱明1于1928年发现的真菌。现今,越来越多的天然产物在临床治疗中使用。
其生产各种次生代谢产物具有不同的生物活性的能力称为一个属是链霉菌 。 链霉菌是革兰氏阳性菌和属于类放线菌和放线菌目的。的临床上使用的抗生素几乎三分之二来自放线菌来源的,主要是从链霉菌属 ,如两性霉素2,达托霉素3或四环素4。两个诺贝尔奖被授予在链霉菌抗生素研究领域。第一个去瓦克斯曼塞尔曼链霉素的发现,第一个tibiotic抗结核病有效。 5 2015年,为诺贝尔生理学或医学奖的一部分,阿维菌素的从阿维链霉菌的发现被评为良好。阿维菌素是用于寄生虫病6,7的治疗。
为天然产物在微生物如链霉菌属发现的传统方法通常包括不同的生长条件下菌株的培养,以及提取和次生代谢产物的分析。生物活性测定(抗菌和抗癌活性如测定)被执行,以检测该化合物的活性。最后,所关注的化合物被分离和化学结构阐明。
天然产物的结构通常由它们形成的复杂分子单一部分的。有一些,但有限的,主要的生物合成途径建设集团KS,它被用于天然产物的生物合成。主要的生物合成途径是聚酮途径,通路,导致使用氨基酸萜类化合物和生物碱,通路和通路,导致糖基。各通路的特征在于一组特定酶8。基于所述化合物的结构,这些生物合成酶可以预测的。
如今,在使用下一代测序和生物信息学分析的组合的化合物的详细的结构分析可以帮助确定负责生物合成基因簇。集群信息开辟了进一步的天然产物研究的新途径。这包括异源表达来增加天然产物的基因缺失或改变,并与来自其他途径的基因组合生物合成的产量,有针对性的复合改性。
Polyketomycin被从培养液中分离独立地两种菌株, 链霉菌 。 MK277-AF1 9和链霉菌diastatochromogenesTü602810。结构通过NMR和X射线分析阐明。 Polyketomycin由四环decaketid和甲基水杨酸,由两个脱氧糖基部分β-D- amicetose和α-L- axenose相连。它显示的细胞毒性和抗菌活性,甚至对革兰氏阳性耐药株如葡萄球菌11。
生成S. diastatochromogenesTü6028的基因组粘粒图书馆和许多年前筛选。使用特定的基因探针polyketomycin基因簇的大小为52.2 kb的,含有41个基因,经过几个月的紧张工作12之后被鉴定。最近,获得S. diastatochromogenes的基因组序列草图通往polyketomycin生物合成基因簇的快速鉴定。在此概述的方法帮助IDENtify一种天然产物并阐明其生物合成基因簇进行说明,使用polyketomycin作为一个例子。
在这里,我们将解释这从天然产物其生物合成基因簇的链霉菌diastatochromogenesTü6028polyketomycin产生所示引领单一步骤。该协议包括具有抗菌性能的天然产物的鉴定和纯化。进一步的结构分析,并与从基因组采矿引线结果向生物合成基因簇的鉴定比较。此过程可以应用到从链霉菌属菌株或任何其他微生物产生的任何其他化合物。
在这个实验中生成的链霉菌diastatochromogenes基因组粘粒文库和多年前筛选,通过极其耗时的过程导致polyketomycin基因簇的鉴定。单个基因的表征是可能使用靶基因缺失和所得突变体12的分析。最近,获得S. diastatochromogenes的基因组序列草图允许polyketomycin生物合成基因簇的快速鉴定。我们可以很容易地检测生物合成基因,虽然基因组序列草图包含还是有很多重叠群。所述方法可以在数月内实现。但是,该过程包括许多步骤。单步骤可能会失败几次,防止发展为后续步骤:
链霉菌属是著名的,以产生生物活性化合物的能力。虽然他们往往携带超过20 BIOSynthetic基因簇,通常只有一个或两个化合物在实验室条件下产生的。在OSMAC方法(在不同条件下一株种植)以唤醒沉默的基因簇的应用程序可能有时是不够的。调节基因,如多效调节基因ADPA 44和bldA 45,46的遗传操作,也是以激活生产其它次级代谢产物的一个有效方法。
该化合物的结构的阐明, 例如 ,通过NMR分析,通常超过2毫克纯化的化合物是必要的。因此,超过10升培养物发酵通常需要。未经发酵罐,其能够维持氧气,pH值和温度条件下,它可能是在一个小的实验室来处理培养和随后的提取该金额有挑战性。在纯化过程中,该化合物可以因氧化,辐射或温度来改变。另外,将使用多个纯化步骤,较高降解的机会。
当分析所述天然产物的结构,并在基因组中的簇,有时是不容易确定合适的集群。首先,如果仅存在一个基因组序列草图集群的某些部分可能会丢失。其次,不这些所需的生物合成所有基因都在群集中。第三,有时一个簇被分成两部分由许多个碱基彼此分离。第四,它可能难以决定哪一个是相应的基因簇。在大的PKS I型或NRPS系统,它是可以计算的延长剂单元根据模块的数量的数量,或者甚至由选择域的分析识别单个延长剂单元的情况下,它变成了容易。然而,在反复工作的情况下酶的合成的化合物的预测通常是不可能的,特别是如果STRA在有40多个基因簇。第五,性质是高度复杂和充满未知化合物。通常的生物合成是不同途径的混合物。如果新的化合物尚未确定,或不相关的另一种化合物,它可能是难以确定的簇,提出一个生物合成模型并证明这一点。
一旦集群被确认,单渡线技术是验证的假设一个良好和快速的方法。 PCR,克隆到自杀载体,结合,阳性克隆的选择和生产试验是唯一需要的步骤。这种技术的一个缺点是,该载体到染色体的整合并不稳定,由于进一步的重组事件。因此,为了进一步分析单个基因时,需要精确的基因缺失。此外,它可能很难操纵在基因水平株链霉菌 。
所描述的过程可以被分配吨Ø由链霉菌菌株或其他微生物产生的任何其他化合物。有关生物合成基因簇及合成的化合物知识为我们提供了更多的机会已经修改现有的分子以改善他们反对耐药病原体斗争的目的。
The authors have nothing to disclose.
S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of Tübingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).
agar | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5210.4 | |
agarose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6352.4 | |
D-mannitol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4175.1 | |
glucose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | |
LB | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X964.3 | |
malt extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X976.2 | |
MgCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2189.1 | |
Peptone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | ||
soy flour | W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany | Hensec-Vollsoja | |
tryptic soy broth | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X938.3 | Caso-Bouillon |
yeast extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Solvents | |||
Acetic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3738.5 | |
Acetone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9372.2 | |
Acetonitrile | Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands | JT-9012-03 | |
Dichlorofrom | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 1530754 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | |
DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D | ARMAR Chemicals, Döttingen, Switzerland | 15200.204 | |
Ethyl acetate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6784.4 | |
Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6331.4 | |
Methanol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 7342.1 | |
Enzymes | |||
restriction enzymes | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
polymerase | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment | Promega GmbH, Mannheim, Germany | ||
Antibiotics | |||
apramycin | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A7682.0005 | |
fosfomycin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany | P5396-50G | |
kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Plasmid/Vectors | |||
pKC1132 | Bierman et al. 1992 | ||
Primer | |||
pokPI_for | TGATGGTGCCGCTGGCCATGG | Primer to amplify fragment containing pokPI gene | |
pokPI_rev | AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC | ||
Bacterial strains | |||
Bacillus subtilis COHN ATCC6051 | Gram-positive test strain | ||
Escherichia coli ET12567 pUZ8002 | MacNeil et al., 1992 | strain for conjugation | |
Escherichia coli XL1 Blue | Agilient Technologies, Santa Clara, USA | Gram-negative test strain + cloning host | |
Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 | Paululat et al., 1999 | Polyketomycin producer | |
Online services | |||
antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell) | http://antismash.secondarymetabolites.org/ | Detection of secondary metabolite gene cluster | |
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | finds regions of similarity between biological sequences | |
GenDB | https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb | Annotation of ORFs | |
MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) | http://mibig.secondarymetabolites.org/ | Database of biosyntetic gene clusters | |
NaPDoS | http://napdos.ucsd.edu/ | Detection of seconary metabolite gene cluster | |
NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ | Annotation of ORFs | |
NRPSpredictor | http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ | Detection of NRPS domains | |
Prokka (rapid prokaryotic genome annotation) | http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml | Annotation of ORFs | |
RAST (rapid annotation using subsystems technology) | http://rast.nmpdr.org/ | Annotation of ORFs | |
other programs | |||
Chem Station Rev. A.09.03 | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | Handling program for HPLC | |
Clone Manager Suite 7 | Scientific and Educational Software, Cary, USA | Designing Cloning Experiment | |
Newbler v2.8 | Roche Diagnostics | Alignment of sequencing reads | |
Machines | |||
Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | ||
HPLC/MS | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Autosampler: G1313A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Column:Xbridge C18 (100 mm × 4.6 mm; Particle size: 3.5 μm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Degasser: G1322A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quarternary pump: G1311A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Diode array detector (DAD )G1315B (λ = 254 nm and 400 nm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
rotary evaporator | |||
_heating bath Hei-VAP Value/G3 | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany | ||
_vacuum pump system SC 920 G | KNF Global Strategies AG, Sursee, Switzerland | ||
other material | |||
Sephadex LH20 | GE Healthcare, | ||
Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 µm; filter Ø15 mm) | MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Germany | ||
SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g) | Waters GmbH, Eschborn, Germany | ||
E. coli | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Bacillus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Streptomyces sp. | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
for agar plates add 2 % agar |