植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

Summary

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Abstract

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Introduction

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems¹. By the introduction of new genes, the plant’s own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine².

Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery³, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)⁴, and electroporation⁵ or polyethylene glycol⁶ treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results⁷. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates⁸. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.

Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer⁹. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.

Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy^10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes^15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic^18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria²¹ or plastids (chloroplasts)²² for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins²³ and either express (plasmid^21,24 or double-stranded DNA²⁵) or down-regulate (double-stranded RNA²⁶) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space^24-26 or within a specific organellar compartment²¹. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K₈) or polylysine-co-histidine (KH)₉ for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

Protocol

ペプチドベースの製剤の調製次のように各ペプチドのストック溶液を準備します（KH）9 -BP100（1ミリグラム/ mlまたは800 nM）を、Cytcox-（KH）9（1 mg / mlで）、BP100（1mg / ml）および（BP100）2 K 8（70μM）。 1.5ミリリットルマイクロチューブに各ペプチドの必要量を計量し、ペプチドを溶解させるためにオートクレーブ滅菌超純水を追加します。透明な溶液が得られるまで繰り返しピペッティングによりよく混合します。 標準的な分子方法に従って、プラスミドDNA（pDNAを）、二本鎖DNA（dsDNA）および二本鎖RNA（dsRNA）を増幅し、精製します。 1.5ミリリットルのマイクロチューブでは、1 mg / mlで（のpDNAおよび二本鎖DNA）または400 nMの（のdsRNA）の濃度の原液を作ります。 炭酸ナトリウム溶液（0.1 M、pHを9）1mlのタンパク質（ 例えば 、アルコールデヒドロゲナーゼ、ADH）粉末1mgを溶解することによって、7μMの濃度のタンパク質ストック溶液を調製します。 fにタンパク質にラベルを付けますローダミンB（RHB）としてluorescentプローブ細胞に送達タンパク質の顕微鏡可視化を可能にするために、標準的なプロトコルに従って。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の各成分を組み合わせます。 ペプチドのpDNA製剤は細胞質を標的とするため、pDNAを（1mg / ml）を20μlに6.4μlの（KH）9 -BP100（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水の773.6μLを加えます。核発現（P35S-RLUC-TNOS、 表1）のために設計されたpDNA構築体を使用してください。 ペプチドのpDNA製剤は、ミトコンドリアを標的とするため、pDNAを（1mg / ml）を20μlにCytcox-の6.6μlの（KH）9（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定化した後、BP100の2.4μlの（1mg / ml）を追加することができます。混合物を25℃で15分間安定化させます6、さらに15分間、C。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水771μlを添加します。ミトコンドリアの式（：RLUC、 表1 pDONR-COX2）のために設計されたpDNA構築体を使用してください。 ペプチドのdsDNA製剤について、二本鎖DNA（1mg / ml）を8μlに5.1μlの（KH）9 -BP100（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水の786.9μLを加えます。 ペプチドのdsRNA製剤については、dsRNA（400 nM）を50μlに50μlの（KH）9 -BP100（800 nM）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためのRNaseフリー水700μlを添加します。 ペプチド-タンパク質製剤のために、ADHの16μlの（7μM）に（BP100）2 K 8（70μM）の16μlを添加し、混合よくピペッティングにより。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水768μlを添加します。 製剤は25℃で15分間安定させます。 ペプチドベースの製剤の2キャラクタリゼーション動的光散乱（DLS）分析用のキュベットに各溶液（800μl）を転送します。 173°の後方散乱検出角度で25℃で633nmのHe-Neレーザーを使用して、ゼータナノサイザーで形成された複合体の流体力学的直径および多分散性指数を決定します。 以下の大きさの測定は、25℃での誘電率、屈折率、水の粘度のデフォルトパラメーターでゼータ電位測定に折り畳まれたキャピラリーセルに各溶液（800μl）を転送します。 原子間力顕微鏡によって、DLS分析のために使用される複合体溶液の少量を、観察（AFM）。マイカシートの新たに露出した切断された表面上にデポジット複合体溶液を10μlとは、カバーされたプラスチックシャーレで一晩乾燥空気にマイカを残します。 モード27,28タッピングに1.3 N /メートルのばね定数を有するシリコンカンチレバーを用いて、25℃の空気中の複合体の画像を取得します。 植物の葉の3浸潤 3週齢の土壌栽培された植物（ シロイヌナズナ 24、 ベンサミアナタバコ 24またはポプラ26）を使用します。遺伝子発現またはタンパク質送達の定量のための三重として機能する少なくとも3つの葉をトランスフェクトします。 1葉のトランスフェクションのための複雑な溶液100μlで1ミリリットル無針プラスチックシリンジをロードします。葉の背軸面にシリンジの先端を置きます。 少し葉に対するシリンジチップを押すと私との対抗圧力をかけながら、ゆっくりとシリンジのプランジャーを押し下げます反対側からラテックス手袋をはめた手のNDEX指。成功浸透葉における水浸領域の広がりとして観察することができます。識別を容易にするために潜入した葉にラベルを付けます。 ペプチドのpDNA（12時間）での浸潤を、次の最適化の期間のためにトランスフェクトされた葉をインキュベートし、ペプチド – 二本鎖DNA（12時間）、ペプチドのdsRNA（9から48時間）、次の条件の下で、ペプチド – タンパク質（6時間）製剤：16時間明/ ベンサミアナタバコのための29℃でのシロイヌナズナとポプラ、または24時間一定の光のために22℃で8時間の暗いです。 トランスフェクション効率の4.評価消費税全体は小さい植物の葉（ 例えば 、 シロイヌナズナ ）以上の植物（ 例えば 、N。ベンサミアナ ）のために潜入した領域の1cm 2のセクションをトランスフェクトしました。 ウミシイタケルシフェラーゼ（Rlucを）レポーターベクターを用いたトランスフェクション実験のために、transfectioを決定n個の効率を定量Rlucをアッセイキットを使用して。 1.5ミリリットルマイクロチューブにそれぞれ切除した葉または葉のセクションを配置します。チューブあたり1×Rlucをアッセイ溶解バッファー100μlを添加します。同様に、非トランスフェクト対照葉（三重）の溶解物を準備します。 均質化乳棒を用いて葉を粉砕し、6、25℃で、得られた溶解物をインキュベート – 10時間。 1分間微量で12470×gで溶解液を遠心分離します。 96ウェルマイクロプレート中でウェルに転送清澄化ライセートを20μlを、製造業者のプロトコルに従って、BCAタンパク質アッセイキットを用いて全タンパク質濃度の定量のための残りの容量を使用します。 ウェルに1×Rlucをアッセイ基質（Rlucをアッセイ緩​​衝液を用いて希釈）の100μlを添加して、ゆっくりとピペッティングにより混合します。マルチモードマイクロプレートリーダーでマイクロプレートを配置し、測定を開始します。 バックグラウンド発光（なしの平均値を減算しますn型トランスフェクト三重）各実験サンプルのルミネセンスから。タンパク質（mg）の量にフォトルミネッセンスの比（相対光単位、RLU）を計算します。 緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターベクターまたは蛍光標識されたタンパク質（ 例えば 、ADH-RHB）を用いてトランスフェクション実験のために、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光を観察します。 あるとして区分された葉を使用することができる一方で、全体の葉（エアスペースの除去を補助するため）のエッジをカットします。 10ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、注射器内の各切除した葉または葉のセクションを配置します。 プランジャーを交換し、葉を粉砕することなく、注射器の底に静かに押し込みます。それが約半分満たされるまで、注射器に水を引きます。 上向きに注射器を指し、先端を通って注射器から空気を除去するために、プランジャーを押し込みます。注射器の先端を覆い、リーから空気を排出するためにゆっくりプランジャーをプルダウンF。葉が半透明に表示されるまで、このプロセスを数回繰り返します。 粘着テープで顕微鏡スライドの表面を覆います。ブレードを使用して、葉のサンプルを収容するのに十分な大きさのテープ上の正方形の領域を切り出し、試料室を作成するためにピンセットでテープの正方形の部分をはがし。テープは、スライドとカバーガラスとの間のスペーサーとして機能します。 背軸面を上に向けてチャンバー内に葉を置き、水で残りのチャンバ領域を埋めます。ガラスカバースリップでチャンバ内に葉を密封し、粘着テープでカバースリップの端を固定します。 40X対物または63X水浸対物レンズ下で共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて葉試料を調べます。 GFPまたはRHB蛍光は、それぞれ、488nmのまたは555ナノメートルの励起波長で可視化することができます。

Representative Results

核酸およびタンパク質の貨物のアレイが正常に送達ベクターとして設計されたペプチドを用いて種々の植物に導入しました。カチオン性ペプチドと、負に帯電した貨物との間の静電相互作用は、直接針注射器（ 図1）を用いて葉植物に浸透することができ、トランスフェクション複合体の形成をもたらしました。植物細胞のトランスフェクションのために最適化された製剤は、（経験的に、これらの研究21,23-26で決定）配信貨物（pDNAを、二本鎖DNAは、dsRNAおよびタンパク質）の広い範囲の各タイプが表現され、表1に記載されています。 300 nmの – すべてのペプチドベースの製剤の平均直径は、150のおおよその範囲でした。 DLS分析に基づいて、すべての製剤が形成されるペプチド – カーゴ凝集体は均一なサイズ分布を有することを示し、相対的に低い大きさの多分散性を示しました。の形態ペプチドとのpDNA（ 図2A）またはタンパク質との間の複合体（ 図2B）は 、雲母に、AFMで画像化しました。均一な球状複合体は、DLS測定からのデータと一致して、ペプチドのpDNAおよびペプチド – タンパク質の組み合わせの両方について観察されました。 dsRNAをベース複合体は中性付近の表面電荷を有していた複合体（ 表1）のゼータ電位の面では、pDNA-および二本鎖DNA由来の複合体は、正味の負の表面電荷を持っていました。ペプチド – タンパク質複合体は、一方で、正に荷電しました。 ペプチドのpDNAとモデルプラントシステムとしてシロイヌナズナやベンサミアナタバコのトランスフェクションを媒介する際のペプチドのdsDNA製剤の効率は定性的ならびに定量的に評価しました。 RLUC遺伝子発現アッセイは、この実験のpDNAのために、したがって、遺伝子発現レベルの定量化（ 表1）のために使用されましたかRLUC遺伝子をコードする二本鎖DNAは、それぞれのキャリアペプチドとの複合体を使用する必要があります。使用（KH）9 -BP100 / pDNAの処方、pDNAの核標的送達および発現は、約1×10 5の推定RLU / mgの値で、12時間のインキュベーション期間の後、達成することができます。 pDNAを、ペプチドの組み合わせのミトコンドリア標的化送達および発現のために、Cytcox-（KH）9及びBP100は、複合体形成のために必要とされます。 12時間の同じ最適化された潜伏期間では、しかし、トランスフェクションのはるかに低いレベル（約1×10 3 RLU / mg）を達成しました。一方、同様のインキュベーション期間（12時間）、および遺伝子発現レベル（約1×10 3 RLU / mg）をさらに9 -BP100ペプチド（KH）を用いて処方、二本鎖DNAに基づく複合体のために記録/必要でした。遺伝子発現の定性評価は錯体preparで処理された葉を直接顕微鏡観察により行いましたEDは、のpDNAを用いて、または二本鎖DNAがGFPレポーター遺伝子をコードします。非標的ペプチドのpDNA複合体でトランスフェクトされた細胞では、GFP発現が明らかに観察され、細胞質ゾル（ 図3A）に局在することが見出されたと対応する緑色蛍光を拡散します。 GFP蛍光の局在パターンにおける明確な違いは、ミトコンドリア標的化ペプチドのpDNA複合体を浸透させた細胞で明らかでした。ここでは、ミトコンドリアの染色と共局在点状の緑色蛍光は、細胞のミトコンドリアのコンパートメント（ 図3B）に独占的に遺伝子発現の特異性が確認された、見えました。 ペプチド – タンパク質製剤の場合には、フルオロフォア（RHB）へのタンパク質カーゴ（ADH）の結合は、細胞内区画内に送達タンパク質の可視化を可能にします。 6時間の短いインキュベーション期間内に、ADH-RHBタンパク質（青）全体に分散されることが見出されましたサイトゾルおよび浸潤した細胞の液胞（ 図3C）。一方、遺伝子発現の迅速かつ効率的なダウンレギュレーションは、ペプチドのdsRNA製剤を用いた各種プラントで達成することができます。ペプチド-dsRNAは干ばつ条件下でアントシアニンを担当するカルコンシンターゼ遺伝子（CHS）（赤色顔料）生合成を沈黙させる複合体で最初の実験では、 シロイヌナズナの葉を浸潤させました。 シロイヌナズナの外観の違いは（ 図3D、a）と干ばつは（ 図3Dは 、b）に最適化されたペプチドのdsRNA製剤を使用して、CHSサイレンシングを評価するための簡単な手段を提供する（矢印1潜入領域を示している）、通常の下に残します。第2の実験では、ペプチドのdsRNA複合体は、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するトランスジェニックシロイヌナズナの葉に浸潤させました。 YFP発現の明らかな減少は表皮細胞9時間Pに見ることができましたOST-トランスフェクション（ 図3E、F）。異なるプラントシステム（ポプラ、12時間後にトランスフェクション）でダウンレギュレートする遺伝子発現の製剤の有効性はまた、（ 図3G、H）を確認しました。 図1： リビング植物への核酸やタンパク質の貨物の配達のためのペプチドベースの製剤。 設計されたキャリアペプチドは、細胞貫通またはオルガネラトランジット配列に結合させ、ポリカチオンで構成されています。ポリカチオンは、細胞内への内在以下のエンドソーム区画からの結合および/または負に帯電した貨物の縮合と同様に脱出可能にします。特定の細胞小器官への細胞内へのカーゴの送達およびその後は、それぞれ、細胞透過配列およびオルガネラ輸送配列によって媒介されます。 successfu可能性があり、様々な貨物LLY植物に送達核酸例えばpDNAを、二本鎖DNAとのdsRNAのような酸、並びにウシ血清アルブミン（BSA）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とシトリン（黄色蛍光タンパク質の変異体）などのモデルタンパク質が挙げられます。生物活性分子は、シリンジ浸潤葉植物に導入されている静電相互作用を介して 、ペプチド結合体でのトランスフェクション複合体を形成することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2： ペプチドベースの製剤のモルフォロジー。 （KH）N / P 0.5で9 -BP100 / pDNAの処方の（A）AFM振幅画像。 （B）（BP100）モルRATIで2 K 8 / ADH製剤のAFM高さ画像O 10は、公開されたソース23,24からの許可を得て転載します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3： 最適化されたペプチドベースの製剤を使用してトランスフェクション効率の微視的評価。 （A）細胞質GFP発現（緑）、葉緑体の自家蛍光（赤）と明確に区別は、 シロイヌナズナのスポンジ状の葉肉細胞は（KH）9 -BP100 / pDNAを処方（N / P 0.5で浸潤葉で観察された。12時間）。 （B）GFP発現（緑）は、各peptidためCytcox-（KH）9 / BP100 / pDNAを処方（N / P 0.5を浸透させたシロイヌナズナの葉の表皮細胞中のミトコンドリア（赤）で検出されました電子; 12時間）。 GFP発現とミトコンドリアの拡大画像は、極端な右パネルに表示されます。 10のペプチド/タンパク質のモル比で（C） シロイヌナズナのスポンジ状の葉肉細胞へのADH-RHB（青）の配信が（BP100）によって媒介される葉2 K 8は 、6時間後の浸潤を可視化しました。前（D） シロイヌナズナの葉の（a）及び（KH）9 -BP100 / dsRNAを製剤（モル比2、48時間）と（b）の処理後、アントシアニン生合成経路の抑制をもたらしました。 GFP5のdsRNAを含有する同様の製剤は、陰性対照（C）のような葉に浸潤させました。矢印2,4は、リーフ内の非浸潤領域を示し、一方、矢印1および3は、浸潤領域を示します。 （E） シロイヌナズナは、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現し、（F）と減少したYFP蛍光以下の浸潤を残します （KH）9 -BP100 /のdsRNA製剤（モル比2; 9時間）。 （G）、黄色蛍光タンパク質（YFP）及び（H）（KH）9 -BP100 / dsRNAを製剤に減少YFP蛍光以下の浸潤発現するトランスジェニックポプラの葉（モル比2; 12時間）。公開されたソース21,23,24,26からの許可を得て複製。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4： ペプチド対DNA（N / P）比および複合体の生物物理学的特性に及ぼす影響の変化。 DNA比にペプチドの増加に伴って、ペプチドベースの製剤は、負から正へのゼータ電位値遷移しながら、サイズが減少します。/files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 表1： 様々なペプチドベースの製剤の特性と評価。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 表2：無傷の植物のためのペプチドをベースと他の既存のDNA送達技術の比較。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

経験的に同定されているプロトコル内の重要なステップが説明されています。シリンジ浸潤によって、ペプチドベースの製剤は、気孔を介して植物の葉の内部空域内に導入されます。植物は、すなわち気孔開口部を助長している条件であるときにソリューションの最大の取り込みを確実にするために、浸透プロセスが実施されるべきである。、十分な水で、ライト期間中に提供されました。トランスフェクション複合体の準備に関しては、（ミトコンドリアを標的DNA送達のための）2つのペプチドの組み合わせを伴う製剤について、各成分の添加順序は重要であり、反転すべきではありません。

手続きに多くのもっともらしいの変更があります。植物細胞の浸潤のための別のオプションは、以下を含む植物全体および/または部分的な組織に複雑なソリューションを導入することができる真空浸潤を使用すること、です頂端分裂組織。この代替的な手順については、苗木は、トランスフェクション溶液に浸漬され、真空によって発生した圧力に基づいて、ペプチド – カーゴ複合体は、気孔を通って植物細胞（吉住、T.、未発表データ）に強制されます。

動物細胞を用いた研究に基づいて、一過性の遺伝子発現は、より高いDNA濃度が^29-31で増加することが示されています。 DNAに対するペプチドの比は、複合体の生物物理学的特性（サイズ、表面電荷）に影響することに注意することはトランスフェクション効率に影響を与える（ 図4）は 、重要です。従って、最適比も増大DNA濃度で維持される必要があります。

遺伝子/タンパク質の送達剤としてのペプチドの使用における主な利点の1つは、その配列が所望の機能を果たすためにチューニングすることが適しているということです。例えば、キャリアペプチドのミトコンドリア標的化ドメインは、このスタッドに記載しますyは、これらの細胞小器官に局在化のため葉緑体またはペルオキシソーム標的化配列で置換することができます。葉緑体の形質転換は、微粒子銃^32-34を使用して^、いくつか^の植物では可能であるが、 アグロバクテリウムやバイオリスティック法のいずれも、核（ 表2）に加えて、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官に遺伝子を導入することができます。

アグロバクテリウムベースの方法（ 表2）とは異なり、ペプチドベースのトランスフェクションには、剛性宿主範囲の制限は、ありません。これまで、 シロイヌナズナのトランスフェクションのための製剤は、 ベンサミアナタバコ及びポプラ（ 表1）を 、最適化されているが、この方法はまた、 タバコに適用することができます トマト品種マイクロトム、米（予備実験に基づく）、および他の単子葉及び双子葉植物。

ペプチドが使用されるとき、まだように、導入遺伝子の大きさには既知の制限は存在しませんトランスフェクションベクター。対照的に、大きなDNA分子は、 アグロバクテリウム媒介法^35,36の形質転換効率、及び^37-39に報告されている約200κBのトランスジーンのためのサイズの上限を減少させることが見出されています。微粒子銃を使用して、一方で、大きなDNA断片を植物³⁸に調製または送達中に剪断することができます。上限は、これまでに遺伝子銃形質転換のために決定されていないが、物理的な制約がはるかに少ない150よりKB ⁴⁰に転送することができるDNAの大きさを制限することが見出されています。上述のアグロバクテリウムまたは微粒子銃のいずれかを使用する既存のアプローチと比較して、遺伝子導入のためのペプチドベースのシステムを使用することの主な利点は、 表2に要約されています。

それが立つようにいくつかの制限は、この方法のために存在します。まず、そのようなMITなどの特定の細胞小器官へのpDNAの配信をターゲットに効率は低かったもののochondria、DNA結合、細胞透過性およびオルガネラ輸送の配列の単純な組み合わせによって可能と証明されています。導入遺伝子の発現は、細胞内のミトコンドリアの小集団において、共焦点顕微鏡によって、検出することができます。細胞/細胞小器官膜を通過する複数の複合体の移動を高める、および（ii）発現のための標的細胞小器官への解離およびキャリアペプチドのpDNAの伝達を改善（I）：従って、さらなる修正は必要にしています。第二に、このDNAの送達システムを使用して、外因性のレポーター遺伝子の一過性発現は、正常細胞の細胞質ゾルおよびミトコンドリア区画に達成されました。植物の核/オルガネラゲノム中に導入された遺伝子の安定した取り込みおよび発現が原因で、適切な選択方法が存在しないために、しかし、まだ確立されていません。

改善やさらなる日間領域があることを認めつつevelopmentは、ここに記載のペプチド由来の戦略は、多様な植物の種類にさまざまな貨物の配達のための道を開いた、シンプルで汎用性の高い技術のまま。

Materials

(KH)9-BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK
BP100 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide	Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute	N/A	Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)	N/A	N/A	Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA	N/A	N/A	For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mL and 10 mL Plastic Syringes	TERUMO Corporation	SS-01T, SS-10ESZ
1.5 mL Microcentrifuge Tube	AS ONE Corporation	151212
96-Well Flat-Bottom Plate	Asahi Glass Co., Ltd.	3860-096
Adhesive Tape	Sekisui Chemical Co., Ltd.	No. 835
Alcohol Dehydrogenase	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A-7011
Atomic Force Microscope	Seiko Instruments Inc.	SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope	Hitachi High-Tech Science Corporation	AFM5300E
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.	23227
Cantilever	Hitachi High-Tech Science Corporation	K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM700
Cork Borer	Sigma-Aldrich Co., LLC.	Z165220	For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip	Matsunami Glass Ind., Ltd.	C02261
Cuvette	Sarstedt	759116
Folded Capillary Cell	Malvern Instruments, Ltd.	DTS1070
Forceps	Shimizu Akira Inc.	Stainless pincet 150
Homogenization Pestle	Ieda Trading Corp.	9993
Mica	Nisshin EM Co., Ltd.	LC23Z
Microcentrifuge	Beckman Coulter	BKA46472
Microplate Reader	Molecular Devices Corporation	Spectra MAX M3
Microscope Slide	Matsunami Glass Ind., Ltd.	S011120
Pipette	Eppendorf Research® plus	3120000909
Pipette Tips	AS ONE Corporation	2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish	AS ONE Corporation	1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit	Promega corporation	E2810
Rhodamine B Isothiocyanate	Sigma-Aldrich Co., LLC.	283924
RNase-Free Water	Qiagen	129112
Sodium Carbonate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-01585
Surgical Blade and Handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap	Musashi Engineering Inc.	NC-3E
Weighing Balance	Sartorius	CPA225D
Zeta Potentiometer	Malvern Instruments, Ltd.	Zetasizer Nano-ZS