השימוש של<em> Ex Vivo</em> הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently
Summary
Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכותרתו.
Abstract
תיוג פלורסנט הוא תהליך ומבוסס לבחינת גורלו של מולקולות שכותרתו תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי הוא במבחנת in vivo. בדיקות ניאון הם שימושיות במיוחד בקביעה-ההפצה ביו של מולקולות גדולות מנוהלות, שבו התוספת של תווית ניאון מולקולות קטנות, ישפיע על קינטיקה או ביו-הפצה של המתחם. מגוון שיטות קיימים לבחון ביו-הפצה להשתנות באופן משמעותי את כמות המאמץ הנדרשת והאם המדידות וכתוצאה מכך הם כמוני מלאים, אבל בשיטות מרובות בשיתוף יכולות לספק מערכת מהירה ויעילה לניתוח ביו-הפצות.
Ex vivo הדמיה-איבר שלם היא שיטה שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את הריכוזים היחסיים במהירות של מולקולות ניאון בתוך רקמות ובין סוגים שונים של רקמות או קבוצות הטיפול. שימוש plat הדמיהטופס מיועד-חי או הדמיה כולו באיברים, קרינה בתוך רקמות שלמות ניתן לקבוע ללא עיבוד נוסף, תוך חיסכון בזמן עבודה תוך מתן תמונה מדויקת של ביו-ההפצה הכוללת. תהליך זה הנו אידיאלי בניסויים מנסים לקבוע את הספציפיות רקמות של תרכובת או עבור ההשוואה של תרכובות שונות מרובות. היסטולוגיה רקמו כמוני המצד השני דורשת עיבוד נוסף נרחב של רקמות על מנת ליצור מדד כמותי של התרכובות שכותרתו. כדי להעריך ביו-הפצה מדויקת, כל הרקמות של עניין חייבות להיות פרוסות, סרק, ונותחו ביחס עקומות סטנדרטיות כדי לערוך השוואות בין רקמות או קבוצות. היסטולוגיה רקמו כמוני הוא תקן זהב להחלטת ריכוזים מתחמים מוחלטים בתוך רקמות.
כאן אנו מתארים כיצד שתי השיטות ניתן להשתמש יחד ביעילות כדי להעריך את היכולת של שיטות ממשל שונות בתnd שינויים במתחם למקד ולספק מולקולות שכותרתו fluorescently למערכת העצבים המרכזית 1.
Introduction
תיוג פלורסנט הוא שיטה מנוצלת בקלות ויעילה לקביעת החלוקה-ביו של תרכובות, באמצעות מגוון של ציוד המשותף במעבדות רבות. Fluorophores זמין באופן נרחב, יחסית לא יקר, מגיע במגוון של אורכי גל, כך מולקולות שכותרתו מרובות ניתן להשתמש בו זמנית ללא הפרעה. לרובם יש fluorophores מגוון של כימיות עבור נטייה לקבוצות תגובתי שונות על תרכובות מטרה, ותהליך הנטייה הוא פשוט בדרך כלל על מרבית סוגי אתרים תגובתי. בנוסף, הציוד הדרוש לשם המדידות של תרכובות שכותרתו fluorescently נפוצים במעבדות רבות. מיקרוסקופים פלורסנט, הדמיה, וסורקים שקופיות יכולים לשמש בנסיבות שונות, מה שהופך את השימוש של תיוג פלורסנט נגיש מאוד. תוויות פלורסנט משמשים לעתים קרובות כדי לקבוע את חלוקת-ביו קינטיקה של תרכובות הן in vivo לשעבר vivo עם מכשירי הדמיה לחיות, כגון Imager ספקטרום IVIS, ועל ידי היסטולוגיה רקמה כמותית 2,3.
שימוש הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים באמצעות התקני הדמיה חיה במהלך השנים גדלות בשל קלות שימוש שלהם ואת היכולת ליצור השוואה מדויקת במהירות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו ללא צורך בעיבוד הנוסף של tissues4. עם זאת, בעוד הדמית vivo לשעבר שלם-איבר יכולה לאפשר ניתוח קל והשוואה, זה לא ליצור מדד כמותי של ריכוזי מתחם מוחלטים בתוך רקמה. זאת בשל תופעות פיזור אור בתוך איברים שלמים. מאז פיזור אור (ו, במידה, ספיגה פחותה) משתנה לפי גודל רקמות צפיפות, הדמיה כולו באיברים יכולה לזלזל רמות רקמות באיברים גדולים או צפופים. גיבוש סטנדרטים מתאימים למדידות ריכוז מוחלטות הוא גם קשה כי צריך לחקות את העוביוצפיפות של כל איבר יחיד. מצד השני, הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה קבלת רמות הרקמות היחסיות של סוכן, והוא אידיאלי עבור השוואה ביו-ההפצה היחסית של מולקולות הקשורות מרובות (כגון במחקרי מיקוד סמים). אסטרטגיה חלופית היא להשתמש היסטולוגיה הקרינה כמותי, טכניקה נגזר שיטת autoradiography כמותיים, כדי להשיג רמות רקמות מוחלט של סוכן הבדיקה 5,6. במקום למקם חיה או איבר שלמה לתוך מכשיר דמיון, היסטולוגיה רקמה כמוני דורשת שכל רקמה להיות פרוסה, רכוב על שקופיות, סרק, ונותחה בנפרד. התקנים של סוכן הבדיקה ערוכים ופרוסים באותו עובי כמו דגימות איברים. על ידי גזירה כל האיברים ותקנים באותו עובי, השתנות עקב פיזור או ספיגת האור מתבטלת, ועוצמת הקרינה ברקמות יכול להיות בכושר כדי עקומת סטנדרט לקבוע concent מוחלטמָנָה. אמנם שיטה זו, כאשר נעשה כראוי, הוא כמוני, הוא גם עתירי עבודה כשלה בקלות. בהתחשב באופי מורכב יותר של היסטולוגיה כמותיים העלות הגבוהה יותר באופן משמעותי של עבודה בהשוואת הדמיה כולו באיברים, הוא הופך להיות כדאי לבחון היכן כל תהליך הוא הכי פרקטי להשתמש כאשר בוחן את ההתפלגות ביו של תרכובות שכותרתו fluorescently. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך שיטות אלה יכולים לשמש יחד כדי להשוות את ביו-הפצה יעילה של פוליפפטיד אלסטין דמוי שכותרתו rhodamine (ELP), עם או בלי תוספת של פפטידים התא חודר SynB1 או טאט, דרך אפי (IN) ו תוך ורידי (IV) נתיבי ממשל.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים היא פשוטה בדרך כלל, ההדבקות כמה מושגים בסיסיים וטכניקות יכולות לשפר את הדיוק של מדידות ביו-הפצה. אורכי גל קצרים של ניסיון אור רמה גבוהה של פיזור וספיגה ברוב הרקמות, אשר באופן משמעותי משפיע על השירות של fluorophores-אורך הגל הקצר. fluorophore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
