El uso de<em> Ex Vivo</em> Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia
Summary
Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método rápido para determinar las concentraciones relativas de los compuestos marcados con fluorescencia dentro de y entre los tejidos o los grupos de tratamiento. Por el contrario, la histología de fluorescencia cuantitativa, mientras que más mano de obra, permite la cuantificación de los niveles tisulares absolutos de moléculas marcadas.
Abstract
Etiquetado fluorescente es un proceso bien establecido para examinar el destino de moléculas marcadas bajo una variedad de condiciones experimentales tanto in vitro como in vivo. Las sondas fluorescentes son particularmente útiles en la determinación de la bio-distribución de las moléculas grandes administrados, donde es probable que afecten a la cinética o bio-distribución del compuesto de la adición de un marcador fluorescente de molécula pequeña. Existe una variedad de métodos para examinar bio-distribución que varían de manera significativa en la cantidad de esfuerzo necesario y si las mediciones resultantes son totalmente cuantitativa, pero el uso de múltiples métodos en combinación puede proporcionar un sistema rápido y eficaz para el análisis de los bio-distribuciones.
Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método que se puede utilizar para comparar rápidamente las concentraciones relativas de las moléculas fluorescentes dentro de los tejidos y entre múltiples tipos de tejidos o grupos de tratamiento. El uso de un plat de imágenesformulario diseñado para animales vivos o de imágenes de todo el órgano, fluorescencia dentro de los tejidos intactos se puede determinar sin más trámite, ahorrando tiempo y mano de obra al tiempo que proporciona una imagen precisa de la bio-distribución general. Este proceso es ideal en los experimentos que tratan de determinar la especificidad de tejido de un compuesto o para la comparación de múltiples compuestos diferentes. la histología del tejido cuantitativa por otro lado requiere una amplia procesamiento adicional de los tejidos con el fin de crear una medida cuantitativa de los compuestos marcados. Para evaluar con precisión la biodistribución, todos los tejidos de interés deben ser cortadas, escanean y se analizaron en relación con las curvas de calibración con el fin de hacer comparaciones entre los tejidos o grupos. histología del tejido cuantitativa es el estándar de oro para determinar las concentraciones de compuestos absolutos dentro de los tejidos.
A continuación, describimos cómo ambos métodos se pueden utilizar juntos de manera eficaz para evaluar la capacidad de los diferentes métodos de administración de unand modificaciones compuestos de objetivo y administrar moléculas marcadas con fluorescencia para el sistema nervioso central 1.
Introduction
etiquetado fluorescente es un método fácilmente utilizado y efectivo para determinar la biodistribución de los compuestos, utilizando una gama de equipos que es común a muchos laboratorios. Los fluoróforos están ampliamente disponibles, relativamente barato, y vienen en una variedad de longitudes de onda, de manera que múltiples moléculas de etiquetado se pueden utilizar simultáneamente sin interferencias. La mayoría de los fluoróforos tienen una gama de químicas para la conjugación con diferentes grupos reactivos en los compuestos de interés, y el proceso de conjugación es generalmente sencillo para la mayoría de tipos de sitios reactivos. Además, el equipo necesario para las mediciones de compuestos marcados con fluorescencia son comunes en muchos laboratorios. microscopios fluorescentes, cámaras y escáneres de diapositivas se pueden usar en diferentes circunstancias, por lo que el uso del etiquetado fluorescente muy accesible. Los marcadores fluorescentes se utilizan con frecuencia para determinar la biodistribución y la cinética de compuestos tanto in vivo como ex vivo con dispositivos de imágenes en vivo, tales como el espectro IVIS Imager, y por la histología del tejido cuantitativa 2,3.
El uso de formación de imágenes ex vivo de todo el órgano utilizando dispositivos de formación de imágenes en vivo se ha incrementado con el tiempo debido a su facilidad de uso y la capacidad para crear rápidamente una comparación precisa de las concentraciones relativas de los compuestos marcados sin requerir el procesamiento posterior de tissues4. Sin embargo, mientras ex vivo de formación de imágenes de todo el órgano puede permitir el análisis y la comparación fácil, que no genera una medida cuantitativa de concentraciones de compuesto absolutos dentro de un tejido. Esto es debido a los efectos de dispersión de luz dentro de los órganos intactos. Desde dispersión de la luz (y, en menor medida, absorbancia) varía según el tamaño y la densidad del tejido, formación de imágenes de todo el órgano puede subestimar los niveles de tejido en órganos grandes o densos. La formulación de estándares apropiados para las mediciones de concentración absoluta también es difícil porque hay que imitar el espesory la densidad de cada órgano individual. Por otro lado, las imágenes de todo el órgano es un método rápido para la obtención de los niveles tisulares relativas de un agente, y es ideal para la comparación de la relación bio-distribución de moléculas relacionadas con múltiples (por ejemplo, en los estudios de la orientación de la droga). Una estrategia alternativa es utilizar la histología de fluorescencia cuantitativa, una técnica derivada de la forma de autorradiografía cuantitativa, para obtener los niveles de tejido absolutos de un agente de prueba 5,6. En lugar de colocar un animal u órgano por completo en un dispositivo de imaginación, la histología del tejido cuantitativa requiere que ser cortado cada tejido, se montaron sobre portaobjetos, exploradas y analizadas individualmente. Normas de agente de ensayo se preparan y en rodajas en el mismo espesor que las muestras de órganos. Al cortar todos los órganos y las normas para el mismo espesor, la variabilidad debido a la dispersión de la luz o la absorbancia se elimina, y la intensidad de fluorescencia de tejidos puede estar en forma a la curva estándar para determinar concent absolutaracionar. Si bien este método, cuando se hace correctamente, es cuantitativa, sino que también es un trabajo intensivo y fácilmente manejado mal. Dada la naturaleza más compleja de la histología cuantitativa y la significativamente mayor costo de mano de obra en comparación con los de formación de imágenes de todo el órgano, se convierte en la pena examinar donde cada proceso es más práctico utilizar cuando se examina la bio-distribución de los compuestos marcados con fluorescencia. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo estos métodos se pueden utilizar juntos para comparar de manera eficiente la bio-distribución de marcado con rodamina elastina-como polipéptido (ELP), con o sin la adición de los péptidos que penetran en células SynB1 o Tat, a través de la intranasal (IN) y (iv) las vías de administración intravenosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien ex vivo de imágenes de todo el órgano es generalmente inmediata, la adhesión a algunos conceptos y técnicas básicas puede mejorar la precisión de las mediciones de la biodistribución. longitudes de onda corta de experiencia luz un alto grado de dispersión y absorción en la mayoría de los tejidos, lo que impacta significativamente la utilidad de los fluoróforos de longitud de onda corta. Estos fluoróforos tienen aplicación en estudios de tejidos profundos limitado, pero se han utilizado con …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
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