Het gebruik van<em> Ex Vivo</em> Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen
Summary
Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.
Abstract
Fluorescentielabelling is een gevestigde werkwijze voor behandeling van het lot van gelabelde moleculen onder verschillende experimentele omstandigheden, zowel in vitro als in vivo. Fluorescerende probes zijn bijzonder nuttig bij het bepalen van de biologische verdeling van toegediende grote moleculen kan toevoeging van een kleine moleculen fluorescent label is onwaarschijnlijk dat de kinetiek of biodistributie van de verbinding beïnvloeden. Diverse methoden bestaan om de biodistributie die aanzienlijk verschillen in de hoeveelheid inspanning vereist en of de verkregen metingen een goed kwantitatief, maar via meerdere methoden in combinatie kunnen snel en doeltreffend systeem voor het analyseren van biologische verdelingen.
Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een werkwijze die kan worden gebruikt om snel de relatieve concentraties van fluorescerende moleculen kunnen vergelijken weefsels en tussen verschillende typen weefsels of behandelingsgroepen. Middels een beeldvormende platformulier ontworpen voor levende dieren of hele-orgel beeldvorming, fluorescentie binnen intact weefsel kan worden bepaald zonder verdere verwerking, bespaart tijd en arbeid, terwijl het verstrekken van een nauwkeurig beeld van de totale bio-distributie. Dit proces is ideaal experimenten poging om de weefselspecificiteit van een verbinding te bepalen of de vergelijking van meerdere verschillende verbindingen. Kwantitatieve weefsel histologie anderzijds vereist uitgebreide verdere behandeling van weefsels om een kwantitatieve maat van de gemerkte verbindingen te maken. Om nauwkeurig te beoordelen bio-distributie, moeten alle weefsels van belang worden gesneden, gescand, en ten opzichte van standaard curves geanalyseerd om vergelijkingen te maken tussen weefsels of groepen maken. Kwantitatieve weefsel histologie is de gouden standaard voor het bepalen van absolute verbinding concentraties in weefsels.
Hier beschrijven we hoe beide methoden samen effectief kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende toedieningsmethoden een beoordelingnd verbinding wijzigingen bij het toewijzen en fluorescent gelabelde moleculen aan het centrale zenuwstelsel 1.
Introduction
Fluorescentielabelling is een gemakkelijk benut en effectieve werkwijze voor het bepalen van de biologische verdeling van verbindingen met een reeks van apparatuur die wordt veel laboratoria voorkomende. Fluoroforen zijn overal verkrijgbaar, relatief goedkoop en zijn in verschillende golflengten, zodat meerdere gelabelde moleculen gelijktijdig kunnen worden gebruikt zonder interferentie. Meeste fluoroforen hebben verschillende chemie voor conjugatie aan verschillende reactieve groepen op doelverbindingen, en het proces van conjugatie algemeen eenvoudiger voor de meeste types reactieve plaatsen. Bovendien moeten de voor de metingen van fluorescent gemerkte verbindingen apparatuur in veel laboratoria. Fluorescerende microscopen, imagers, en schuif scanners kunnen allemaal worden gebruikt in verschillende omstandigheden, waardoor het gebruik van fluorescerende labeling zeer toegankelijk. Fluorescerende merkers worden veelvuldig gebruikt om de biodistributie en kinetiek van verbindingen zowel in vivo als ex viv bepaleno met live imaging-apparaten, zoals de IVIS Spectrum Imager, en door middel van kwantitatieve weefsel histologie 2,3.
Het gebruik van ex vivo geheel-orgaan beeldvorming met levende-beeldvorming is toegenomen in de tijd vanwege hun gebruiksgemak en het vermogen om snel een nauwkeurige vergelijking van de relatieve concentraties van gelabelde verbindingen te maken zonder dat de verdere verwerking van tissues4. Hoewel ex vivo gehele orgaan beeldvorming kan zorgen voor een gemakkelijke analyse en vergelijking, genereert geen een kwantitatieve maat absolute verbinding concentraties in weefsel. Dit komt door lichtverstrooiing effecten op organen intact. Aangezien lichtverstrooiing (en, in mindere mate, absorptie) afhankelijk van weefselgrootte en dichtheid kunnen geheel-orgaan imaging onderschatten weefselconcentraties in grote of dichte organen. Het formuleren van de juiste normen voor de absolute concentratie metingen is ook moeilijk omdat men de dikte moet nabootsenen dichtheid van elk orgaan. Anderzijds, hele organen beeldvorming is een snelle methode om de relatieve weefselconcentraties van een middel, en het is ideaal voor het vergelijken van de relatieve biodistributie van meerdere gerelateerde moleculen (zoals drug targeting studies). Een andere mogelijkheid is kwantitatieve fluorescentie histologie, een techniek afgeleid van de werkwijze van kwantitatieve autoradiografie gebruiken, absolute weefselconcentraties van een testmiddel 5,6 te verkrijgen. In plaats van het plaatsen van een hele dier of orgaan in een verbeelding apparaat, kwantitatieve weefsel histologie vereist dat elk weefsel worden gesneden, gemonteerd op dia's, gescand en individueel geanalyseerd. Normen van het testmiddel worden bereid en gesneden op dezelfde dikte als orgaanmonsters. Door snijden van alle organen en normen dezelfde dikte, is variatie door licht verstrooiing of absorptie verwijderd en weefsel fluorescentie-intensiteit kan fit met de standaardkromme om te bepalen absolute concentrantsoen. Hoewel deze methode, wanneer goed uitgevoerd, is kwantitatief, is arbeidsintensief en gemakkelijk verkeerd. Gezien de complexe aard van kwantitatieve histologie en de aanzienlijk hogere arbeidskosten in vergelijking met hele-orgaan beeldvorming, wordt het zinvol te onderzoeken waarbij elk proces het meest praktisch in gebruik bij het onderzoek van de biologische verdeling van fluorescent gemerkte verbindingen. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van deze werkwijzen samen kunnen worden gebruikt om efficiënt vergelijken de biodistributie van rhodamine gemerkte elastine-achtig polypeptide (ELP), met of zonder toevoeging van de SynB1 of Tat-cel penetrerende peptiden, via de intranasale (IN) en intraveneuze (IV) toediening routes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl ex vivo hele orgel beeldvorming is over het algemeen eenvoudig, kan de naleving van een aantal fundamentele concepten en technieken de nauwkeurigheid van bio-distributie metingen te verbeteren. Korte golflengten van lichtervaring een hoge mate van verstrooiing en absorptie in de meeste weefsels, die aanzienlijk invloed op de bruikbaarheid van de korte-golflengte fluoroforen. Deze fluoroforen hebben een beperkte toepassing in diepe weefsel studies, maar ze zijn effectief gebruikt in experimenten te kijke…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
