In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung
Summary
Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Abstract
Brennen Infektionen weiterhin eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das zunehmende Auftreten von mehrfach arzneimittelresistenten (MDR) Bakterien ist das häufige Versagen der traditionellen Antibiotika-Behandlungen geführt. Alternative Therapien sind dringend zu bekämpfen MDR Bakterien benötigt.
Ein innovativer nicht-Antibiotikum Ansatz, antimikrobielle blaues Licht (abl) hat vielversprechende Wirksamkeit gegen MDR-Infektionen gezeigt. Der Wirkmechanismus von Abl ist noch nicht gut verstanden. Es wird allgemein angenommen , dass natürlich endogenes Photosensibilisator Chromophore in Bakterien (beispielsweise eisenfreien Porphyrinen, Flavine, etc.) auftritt durch Abl angeregt werden, die wiederum zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch einen photochemischen Prozeß erzeugt.
Im Gegensatz zu anderen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz, antimikrobiellen Photodynamischen Therapie (aPDT), Abl Therapie erfordert nicht die Beteiligung eines exogenen photosensitizer. Alles was es braucht zu übernehmen ist die Bestrahlung mit blauem Licht; daher ist es einfach und kostengünstig. Die abl-Rezeptoren sind die endogenen zellulären Photosensibilisatoren in Bakterien, anstatt die DNA. Somit wird angenommen, dass viel weniger abl genotoxisch sein, Zellen als ultraviolett-C (UVC) Bestrahlung Host, die DNA-Schäden direkt in Wirtszellen verursacht.
In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll , um die Wirksamkeit der abl – Therapie für MDR Acinetobacter baumannii Infektionen in einem Mausmodell der Brandverletzung zu bewerten. einen angelegten Biolumineszenz-Stammes Durch den Einsatz konnten wir das Ausmaß der Infektion in Echtzeit in lebenden Tieren nicht-invasiv überwachen. Diese Technik ist auch ein wirksames Instrument für die räumliche Verteilung von Infektionen bei Tieren zu überwachen.
Introduction
Brennen Infektionen, die wegen der Haut thermischer Verletzungen häufig gemeldet werden, weiterhin 1 eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das Management von Burn – Infektionen wurde durch die zunehmende Auftreten von multiresistenten (MDR) Bakterienstämmen 2 aufgrund des massiven Einsatz von Antibiotika weiter beeinträchtigt. Ein wichtiger MDR Gram-negative Bakterien ist Acinetobacter baumannii, die bekanntlich mit den jüngsten Kampfwunden in Verbindung gebracht werden und ist beständig gegen fast alle verfügbaren Antibiotika 3. Die Anwesenheit von Biofilmen an dem verletzten Foci wird 4 berichtet, 5 und wird angenommen , dass die Toleranz gegenüber Antibiotika und Wirtsabwehr 6, 7, persistente Infektionen verursacht 8, 9 zu verstärken. Daher ist es eine pressing benötigt für die Entwicklung von alternativen Behandlungen. In der angekündigten Nationalen Strategie vor kurzem für die Bekämpfung von Antibiotika-resistenten Bakterien hat die Entwicklung alternativer Therapeutika gegen Antibiotika als eine Aktion von der Regierung der Vereinigten Staaten 10 zur Kenntnis genommen.
Licht basierende antimikrobielle Ansätze, wie der Name schon sagt, erfordern Lichtbestrahlung mit oder ohne andere Mittel. Diese Ansätze schließen antimikrobielle Photodynamischen Therapie (aPDT), UV-C (UVC) Bestrahlung und antimikrobielle blaues Licht (abl). In früheren Studien haben sie vielversprechende Wirksamkeit bei der Abtötung von MDR Bakterienstämmen 11, 12, 13 gezeigt. Unter den drei lichtbasierte Ansätze hat abl Aufmerksamkeit auf sich gezogen in den letzten Jahren zunehmend aufgrund ihrer intrinsischen antibakterielle Eigenschaften ohne die Verwendung von Photosensibilisatoren 14. in comparIson zu aPDT beinhaltet abl nur die Verwendung von Licht, während aPDT eine Kombination von Licht und Photosensibilisator erfordert. Daher ist abl einfach und kostengünstig 14. Im Vergleich zu UVC wird abl glaubt viel weniger zytotoxische und genotoxisch seine Wirtszellen 15.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit von Abl zur Behandlung von Verbrennungen Infektionen durch MDR A. baumannii in einem Mausmodell verursacht zu untersuchen. Wir verwenden Biolumineszenz-pathogene Bakterien neue Mausmodelle von Burn-Infektionen zu entwickeln, die der nicht-invasive Überwachung der bakteriellen Belastung in Echtzeit ermöglichen. Im Vergleich zu der traditionellen Methode der Körperflüssigkeit / Gewebe – Probennahme und anschließende Plattieren und Koloniezählung 16, liefert diese Technik eines genauen Ergebnisse. Der Prozess der Gewebeprobenentnahme kann eine andere Quelle von experimentellen Fehler einzuführen. Da die bakterielle ist Lumineszenzintensität zu dem entspre linear proportionalPonding 17 CFU Bakterien, können wir das Überleben der Bakterien nach einer bestimmten Dosis der Bestrahlung mit Licht direkt messen. Durch die Überwachung kann die bakterielle Belastung in lebenden Tieren, das Licht Behandlung in Echtzeit empfängt, die Kinetik der Bakterienabtötung charakterisiert wird eine deutlich reduzierte Anzahl von Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abl ist ein neues Verfahren zur Behandlung von Infektionen. Seit seinem Wirkungsmechanismus von der Chemotherapie völlig anders ist, ist es eher eine Physiotherapie. Das Mittel, das die antimikrobielle Wirkung vermittelt ist blaue Licht-Bestrahlung (400-470 nm). Mit der Entwicklung von blauen LEDs, gewannen wir den Zugang zu einem effektiven und einfachen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz für MDR-Infektionen.
In diesem Protokoll haben wir die Entwicklung eines Mausmodell von burn – In…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
Materials
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
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