JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Drosophila Voorbereiding en longitudinale beeldvorming van het hart functie in vivo met behulp van Optical Coherence Microscopy (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Longitudinaal onderzoek naar het hart bij gezelschapsdieren bijdraagt tot het begrijpen van diverse humane gerelateerde hart- en vaatziekten, zoals gentherapie betrekking aangeboren hartafwijkingen 1,2. In de afgelopen decennia verschillende diermodellen zoals muizen 3,4, 5,6 Xenopus, zebravis 7,8, vogel 9 en Drosophila 10-16, zijn gebruikt om het menselijk hart ontwikkelingsgerelateerd onderzoek. Het muizenmodel is op grote schaal gebruikt om de normale en abnormale ontwikkeling van het hart en hartafwijking fenotypes vanwege de overeenkomsten met het menselijk hart 3,4 bestuderen. De Xenopus embryo is bijzonder nuttig bij de studie van ontwikkeling van het hart vanwege de gemakkelijke hantering en gedeeltelijke transparantie 5,6. De transparantie van het embryo en de vroege larve van de zebravis model zorgt voor eenvoudige optische observatie van de ontwikkeling van het hart 7,8. De aviaire model is een gemeenschappelijk onderwerp van ontwikkelingsstoornissen hart studies Because het hart is eenvoudig te bereiken na verwijdering van de eierschalen en de morfologische gelijkenis van aviaire harten voor de mens 9. De Drosophila model heeft een aantal unieke eigenschappen waardoor het ideaal is voor het uitvoeren van longitudinale studies van het hart te maken. Ten eerste, het hartbuis van Drosophila is ~ 200 urn onder het dorsale oppervlak, die gemak biedt voor optische toegang en observatie van het hart. Bovendien zijn veel moleculaire mechanismen en genetische pathways zijn geconserveerd tussen Drosophila en vertebraten. De orthologen van meer dan 75% van humane ziekte genen gevonden in Drosophila, waardoor het al op grote schaal gebruikt in transgene studies 11,13. Bovendien heeft het een korte levensduur en lage onderhoudskosten, en is vaak gebruikt als een specimen model voor de ontwikkelingsbiologie onderzoek 14-16.

Eerdere rapporten beschreven protocollen voor het bewaken Drosophila hartfunctie zoals hijArtbeat. Er werden echter dissectie vereiste procedures 17,18. Optische beeldvorming is een effectieve manier om ontwikkeling van het hart bij dieren visualiseren gezien het niet-invasieve karakter. Verschillende optische beeldvormende technieken zijn toegepast bij het uitvoeren van dierlijke cardiale studie, zoals twee-foton microscopie 19, confocale microscopie 20,21, licht blad microscopie 22, en optical coherence tomography (OCT) 16,23-26. Relatief, oktober is in staat om grote diepte beeldvorming in kleine dieren harten zonder contrastmiddelen, terwijl een hoge resolutie en een ultrahoge snelheid van de beeldvorming, die belangrijk zijn voor beeldvorming levende dieren. Bovendien heeft de lage kosten van het ontwikkelen van een systeem oktober deze techniek voor optische beeldvorming van monsters populair. Oktober is met succes gebruikt voor longitudinale studie van Drosophila. Met behulp van oktober, cardiale morfologische en functionele beeldvorming is uitgevoerd naar het hart structuren te bestuderen, de funcnele functies van genen en de mechanismen van cardiovasculaire defecten in mutant modellen tijdens ontwikkeling van het hart. Zo werd leeftijdsafhankelijke hartfunctie daling bevestigd-down gereguleerd-angiotensine converting enzyme-gerelateerde (ACER) gen in Drosophila met 27 oktober. Fenotypering van gen-gerelateerde cardiomyopathie werd aangetoond in Drosophila met behulp van oktober 28-33. Onderzoek met behulp van oktober bleek ook de functionele rol van het menselijke SOX5 gen in het hart van Drosophila 34. In vergelijking met oktober, OCM maakt gebruik van een objectief met een hogere numerieke lensopening om een ​​betere transversale oplossing te bieden. In het verleden heeft het hart disfunctioneren veroorzaakt door silencing een ortholoog circadiane gen dCry / dClock bestudeerd met behulp van een aangepast systeem OCM 15,16, evenals het effect van vetrijk dieet op cardiomyopathie in Drosophila tot obesitas geïnduceerde humane begrijpen hartziekten. 15

Hier, the experimentele protocol is samengevat voor longitudinaal onderzoek naar de cardiale morfologische en functionele veranderingen in Drosophila op het tweede instar (L2), derde instar (L3), pop dag 1 (PD1), pop dag 2 (PD2), pop dag 3 (PD3) , poppen dag 4 (PD4), pop dag 5 (PD5) en volwassen (figuur 1) via OCM om het onderzoek naar menselijke-gerelateerde aangeboren hartziekten vergemakkelijken. Cardiale functionele parameters, zoals HR en GLB werden kwantitatief geanalyseerd in verschillende ontwikkelingsstadia om de cardiale ontwikkelingsfuncties onthullen.

Protocol

1. Voorbereiding van de OCM-systeem voor optische beeldvorming van Drosophila 16 Selecteer een spectrometer en een hogesnelheidslijn scan camera met een frame rate van ten minste 80 frame / sec biedt zodat de OCM-systeem in staat om de hartslag van Drosophila te lossen zal zijn. Gebruik een breedband lichtbron om de axiale resolutie van 2 urn te garanderen aan de hartstructuur van Drosophila identificeren. Gebruik een 10X doelstelling om een ​​hoge…

Representative Results

De longitudinale cardiale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de fruitvliegen met 24B-GAL4 / + rek bij kamertemperatuur OCM. De metingen werden uitgevoerd bij L2, L3, en 8 uur intervallen van PD1 tot PD4, en volwassen dag 1 (AD1) aan de metamorfoseprocédé (tabel 1) te volgen. Larven, poppen vroege, late poppen en volwassen vliegen werden gemonteerd op glasplaatjes zoals in Figuur 1A. Het segment kenmerken van het hart voor larven en volwassen vliegen werden getoond in de schem…

Discussion

De snelle hartslag van Drosophila, met een maximum HR rond de 400 slagen per minuut bij larven en volwassen stadia, vereist een hoge snelheid van de beeldvorming naar het hart diastoles en systolen (niet minder dan 80 beelden / sec op basis van ervaringen) op te lossen. Vanwege de kleine afmetingen en hartkamer micron schaal hart wanddikte (5-10 urn), een hoge ruimtelijke resolutie (beter dan 2 pm) vereist voor het oplossen van het hartbuis structuren. In deze studie, een hoge resolutie en ultrahoge snelheid OC…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image