JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

دراسة طولية من القلب في الحيوانات الصغيرة تساهم في فهم مجموعة متنوعة من أمراض القلب والشرايين المتصلة بها الإنسان، مثل المتعلقة الجين عيوب القلب الخلقية 1،2. في العقود الماضية، نماذج حيوانية مختلفة، مثل 3،4 الماوس، القيطم 5،6، 7،8 الزرد، الطيور 9، وذبابة الفاكهة 10-16، وقد استخدمت لإجراء الإنسان القلب وتطوير الأبحاث ذات الصلة. وقد استخدم على نطاق واسع في نموذج الفأر لدراسة تطوير القلب العادية وغير العادية والظواهر عيب في القلب بسبب التشابه مع 3،4 قلب الإنسان. الجنين القيطم يكون مفيدا بشكل خاص في دراسة التنمية القلب نظرا لسهولة التعامل والجزئي 5،6 الشفافية. الشفافية في جنين واليرقة في وقت مبكر من طراز الزرد يسمح للمراقبة البصرية سهلة من 7،8 تطوير القلبية. نموذج الطيور هو موضوع مشترك للدراسات القلب التنموية becausالبريد قلب يمكن الوصول إليها بسهولة بعد إزالة قشر البيض والتشابه الصرفي من قلوب الطيور إلى البشر 9. نموذج ذبابة الفاكهة لديه بعض الميزات الفريدة التي تجعله مثاليا لإجراء دراسات طولية من القلب. أولا، وأنبوب القلب من ذبابة الفاكهة هو ~ 200 ميكرون تحت السطح الظهري، التي توفر الراحة للوصول البصرية ومراقبة القلب. بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها العديد من الآليات الجزيئية ومسارات الوراثية بين ذبابة الفاكهة والفقاريات. تم العثور على orthologs أكثر من 75٪ من جينات المرض الإنسان في ذبابة الفاكهة، والتي جعلت من استخدامها على نطاق واسع في الدراسات المعدلة وراثيا 11،13. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه دورة حياة قصيرة وانخفاض تكاليف الصيانة، وكان يشيع استخدامها كنموذج عينة للبحوث البيولوجيا التطورية 14-16.

ووصفت التقارير السابقة البروتوكولات لرصد وظائف القلب ذبابة الفاكهة مثل انهartbeat. ومع ذلك، كان مطلوبا إجراءات تشريح 17،18. يوفر التصوير الضوئي وسيلة فعالة لتصور تطور القلب في الحيوانات نظرا لطبيعتها غير الغازية. وقد تم تطبيق مختلف طرائق التصوير الضوئي في أداء الحيوان دراسة القلب، مثل ثنائي الفوتون المجهري 19، الفحص المجهري متحد البؤر 20،21، وعلى ضوء ورقة الفحص المجهري 22، والتصوير المقطعي التماسك البصري (أكتوبر) 16،23-26. نسبيا، أكتوبر قادرة على توفير عمق التصوير عظيم في قلوب الحيوانات الصغيرة دون استخدام عوامل التباين، مع الحفاظ على دقة عالية وسرعة التصوير عالية جدا، والتي هي مهمة لتصوير الحيوانات الحية. بالإضافة إلى ذلك، انخفاض تكلفة تطوير نظام أكتوبر وقد عمرت هذه التقنية للتصوير الضوئي من العينات. وقد استخدم أكتوبر بنجاح لدراسة طولية من ذبابة الفاكهة. باستخدام أكتوبر، وقد تم إجراء القلب التصوير المورفولوجية والوظيفية لدراسة هياكل القلب، وظائفهاالأدوار tional من الجينات، وآليات عيوب القلب والأوعية الدموية في نماذج متحولة خلال تطوير القلب. على سبيل المثال، تم تأكيد تعتمد على سن انخفاض وظيفة القلب مع (ACER) الجين التنظيم أسفل المحول للأنجيوتنسين المتعلقة الانزيم في ذبابة الفاكهة مع 27 أكتوبر. وقد تجلى Phenotyping من اعتلال عضلة القلب المتعلقة الجيني في ذبابة الفاكهة باستخدام أكتوبر 28-33. كما كشفت الأبحاث التي تستخدم أكتوبر دور وظيفي من الجينات SOX5 البشري في قلب ذبابة الفاكهة 34. مقارنة مع أكتوبر، يستخدم OCM هدفا مع الفتحة العددية أعلى لتوفير تحليل أفضل عرضية. في الماضي، وقد تمت دراسة الخلل القلب الناجم عن إسكات الجينات الساعة البيولوجية البشرية ortholog dCry / dClock باستخدام نظام OCM مخصصة 15،16، فضلا عن تأثير ارتفاع الدهون الحمية على بعضلة القلب في ذبابة الفاكهة لفهم السمنة التي يسببها الإنسان أمراض القلب. 15

هنا، التتلخص البريد بروتوكول تجريبي لدراسة طولية من التغيرات الشكلية والوظيفية القلب في ذبابة الفاكهة في الطور الثاني (L2)، الطور الثالث (L3)، يوم خادرة 1 (PD1)، يوم خادرة 2 (PD2)، خادرة يوم 3 (PD3) ، خادرة يوم 4 (PD4)، يوم خادرة 5 (PD5)، والكبار (الشكل 1) باستخدام OCM لتسهيل دراسة أمراض القلب الخلقية المتعلقة الإنسان. وقد تم تحليل المعلمات الوظيفية القلب، مثل الموارد البشرية وCAP كميا في مراحل النمو المختلفة للكشف عن ملامح التطوير في القلب.

Protocol

1. إعداد نظام OCM للتصوير الضوئي من ذبابة الفاكهة 16 حدد مطياف وخط عالية السرعة كاميرا المسح الضوئي التي توفر الإطار معدل لا يقل عن 80 إطار / ثانية وبالتالي فإن النظام OCM سوف تكون قادرة على حل ضربات القلب من ذبا…

Representative Results

أجري تصوير القلب طولية باستخدام ذبابة الفاكهة مع 24B-GAL4 / + السلالة في درجة حرارة الغرفة مع OCM. أجريت القياسات في L2، L3، وفي 8 فترات ساعة من PD1 إلى PD4، ويوم والكبار 1 (AD1) لتتبع عملية التحول (الجدول 1). وقد شنت يرقة، خادرة في وقت مبكر، في وقت متأخر خادرة والكبار الذباب ع…

Discussion

وسرعة ضربات القلب من ذبابة الفاكهة، مع حد أقصى لHR حوالي 400 نبضة في الدقيقة في مراحل اليرقات والكبار، يتطلب عالية السرعة التصوير لحل الإنبساط القلب والإنقباضات (ما لا يقل عن 80 لقطة / ثانية استنادا إلى الخبرات). نظرا لصغر حجم الغرفة القلب وميكرون على نطاق وسمك جدار ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

Keywords: DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction
check_url/fr/55002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image