JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

Drosophila Forberedelse og Longitudinal Imaging of Heart Funktion in vivo Brug Optisk Kohærens mikroskopi (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Longitudinal undersøgelse af hjertet i små dyr bidrager til at forstå en række humane relaterede hjerte-kar-sygdomme, såsom gen relateret medfødt hjertefejl 1,2. I de seneste årtier, forskellige dyremodeller, såsom mus 3,4, Xenopus 5,6, zebrafisk 7,8, aviær 9, og Drosophila 10-16, er blevet anvendt til at udføre det menneskelige hjerte-udvikling forskning. Musemodellen er blevet bredt anvendt til at undersøge normale og unormale hjerte- udvikling og hjertefejl fænotyper på grund af sine ligheder med det menneskelige hjerte 3,4. Xenopus embryo er især nyttig ved undersøgelse af hjertet udvikling på grund af sin nemme håndtering og delvis gennemsigtighed 5,6. Gennemsigtigheden af embryo og tidlig larve af zebrafisk model giver mulighed for nem optisk observation af hjerte-udvikling 7,8. Den aviær model er en fælles genstand for udviklingsmæssige hjerte undersøgelser because hjertet er nemt tilgængelige efter fjernelse af æggeskaller og den morfologiske lighed aviær hjerter til mennesker 9. Drosophila model har nogle unikke funktioner, som gør den ideel til udførelse langsgående studier af hjertet. Først, hjertet tube Drosophila er ~ 200 um under den dorsale overflade, som tilvejebringer bekvemmelighed for optisk adgang og observation af hjertet. Derudover er mange molekylære mekanismer og genetiske pathways konserveret mellem Drosophila og hvirveldyr. De orthologer på over 75% af de menneskelige sygdomsgener blev fundet i Drosophila, som har gjort det meget udbredt i transgene undersøgelser 11,13. Desuden har en kort livscyklus og lave vedligeholdelsesomkostninger, og har været almindeligt anvendt som en model model for udviklingsbiologi forskning 14-16.

Tidligere rapporter beskrev protokoller til overvågning Drosophila hjertefunktion som hanArtbeat. Imidlertid blev dissektion procedurer påkrævet 17,18. Optisk afbildning tilvejebringer en effektiv måde at visualisere kardial udvikling hos dyr på grund af sin ikke-invasiv art. Forskellige optiske billeddiagnostiske metoder er blevet anvendt ved udførelse af dyr cardiac undersøgelse, såsom to-foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, lys ark mikroskopi 22, og optisk kohærens tomografi (OCT) 16,23-26. Forholdsvis, OCT kan levere store billedbehandling dybde i små dyr hjerter uden at bruge kontrastmidler, og samtidig holde en høj opløsning og et ultrahøjt billeddannelseshastighed, som er vigtige for billeddannelse levende dyr. Derudover har de lave omkostninger ved at udvikle et OLT-system populariseret denne teknik til optisk billeddannelse af prøver. Oktober er med succes blevet anvendt til forløbsundersøgelse af Drosophila. Brug af OLT hjerte- morfologisk og funktionel billeddannelse er blevet udført for at undersøge hjertet strukturer, den funcnelle roller gener og mekanismerne for kardiovaskulære defekter i mutant modeller i hjerte-udvikling. For eksempel blev aldersafhængig hjertefunktion tilbagegang bekræftet med nedreguleret angiotensin-konverterende enzym-relateret (ACER) gen i Drosophila med 27 oktober. Fænotypebestemmelse af gen-relateret kardiomyopati blev påvist i Drosophila hjælp oktober 28-33. Forskning ved hjælp oktober afslørede også den funktionelle rolle af den menneskelige SOX5 gen i hjertet af Drosophila 34. Sammenlignet med OLT OCM bruger et objektiv med en højere numerisk apertur at give bedre tværgående opløsning. I fortiden, har hjertet dysfunktion forårsaget af silencing en ortholog human circadian gen dCry / dClock undersøgt under anvendelse af et brugerdefineret OCM-system 15,16, samt virkningen af højt fedtindhold-kost på kardiomyopati i Drosophila at forstå fedme induceret human hjertesygdomme. 15

Her, the forsøgsprotokol er sammenfattet til langsgående undersøgelse af de hjerte-morfologiske og funktionelle ændringer i Drosophila på andet stadium (L2), tredje stadie (L3), puppe dag 1 (PD1), puppe dag 2 (PD2), puppe dag 3 (PD3) , puppe dag 4 (PD4), puppe dag 5 (PD5), og voksne (figur 1) ved hjælp af OCM at lette undersøgelse af menneskelige relaterede medfødte hjertesygdomme. Hjerte funktionelle parametre, såsom HR og CAP blev kvantitativt analyseret på forskellige udviklingsstadier at afsløre hjertets udviklingstræk.

Protocol

1. Udarbejdelse af OCM System for Optical Imaging af Drosophila 16 Vælg et spektrometer og en high-speed line scan kamera, der giver en ramme på mindst 80 frame / sek, så OCM-systemet vil være i stand til at løse hjerteslag Drosophila. Brug en bredbåndsforbindelse lyskilde til at sikre den aksiale opløsning på 2 um for at identificere hjertet struktur Drosophila. Brug en 10X mål at opnå en høj tværgående opløsning. Brug en 45 °…

Representative Results

Den langsgående billeddannelse af hjertet blev udført under anvendelse af de frugtfluer med 24B-GAL4 / + stamme ved stuetemperatur med OCM. Målinger blev udført ved L2, L3, og ved 8 timers intervaller fra PD1 til PD4, og voksen dag 1 (AD1) til at spore metamorfose proces (tabel 1). Larve, tidlig puppe, sen puppe og voksne fluer blev monteret på objektglas, som ses i figur 1A. Segmentaktiverne funktioner i hjertet for larve- og voksne fluer blev vist i de skematiske repræsentatione…

Discussion

Den hurtige hjerteslag Drosophila, med en maksimal HR omkring 400 bpm på larver og voksne stadier, kræver høj billeddannelseshastighed at løse hjertet diastoles og systoles (ikke mindre end 80 billeder / sek baseret på erfaringer). På grund af den lille hjertekammeret størrelse og micron skala hjerte vægtykkelse (5 – 10 um), en høj rumlig opløsning (bedre end 2 um) er påkrævet for at løse de hjerte rørstrukturer. I denne undersøgelse blev en høj opløsning og ultrahøj hastighed OCM system udvik…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

Keywords: DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction
check_url/fr/55002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image