Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Étude longitudinale du cœur chez les petits animaux contribue à la compréhension d' une variété de maladies cardiovasculaires liées humaines, comme gènes liés à des malformations cardiaques congénitales ^1,2. Au cours des dernières décennies, divers modèles animaux, tels que le ^3,4 de la souris, Xenopus ^{5,6, 7,8} zebrafish, aviaire ^9, et Drosophila ^10-16, ont été utilisées pour mener le cœur du développement humain recherche liée. Le modèle de souris a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque normal et anormal et phénotypes de défauts cardiaques en raison de ses similitudes avec le ^3,4 cœur humain. L'embryon de Xenopus est particulièrement utile dans l'étude du développement cardiaque due à sa facilité de manipulation et partielle ^5,6 transparence. La transparence de l'embryon et larve début du modèle zebrafish permet l' observation optique facile cardiaque ^7,8 de développement. Le modèle aviaire est un sujet commun d'études cardiaques développement because le cœur peut être facilement accessible après avoir retiré les coquilles et la similitude morphologique des coeurs aviaires aux humains ^9. Le modèle drosophile a des caractéristiques uniques qui le rendent idéal pour la réalisation d' études longitudinales du cœur. Tout d' abord, le tube du coeur de la drosophile est d' environ 200 um en dessous de la surface dorsale, qui fournit un accès facilité pour l' observation optique et du coeur. En outre, de nombreux mécanismes moléculaires et les voies génétiques sont conservées entre la drosophile et les vertébrés. Les orthologues de plus de 75% des gènes de maladies humaines ont été trouvées chez la drosophile, qui ont fait largement utilisé dans les études transgéniques ^11,13. En outre, il a un cycle de vie court et faibles coûts de maintenance, et a été couramment utilisé comme un modèle exemplaire pour la recherche sur la biologie du développement ^14-16.

Les rapports précédents ont décrit les protocoles de surveillance de la fonction cardiaque chez la drosophile comme le luiartbeat. Toutefois, les procédures de dissection ont été nécessaires ^17,18. L'imagerie optique fournit un moyen efficace pour visualiser le développement cardiaque chez les animaux en raison de sa nature non-invasive. Différentes modalités d'imagerie optique ont été appliquées dans l' exécution de l' étude cardiaque des animaux, tels que la microscopie à deux photons ^19, microscopie confocale ^20,21, microscopie nappe de lumière ^22, et tomographie par cohérence optique (OCT) ^16,23-26. Comparativement, EAO est capable de fournir une grande profondeur d'imagerie dans les petits coeurs des animaux sans l'aide d'agents de contraste, tout en conservant une haute résolution et une vitesse d'imagerie ultravide, qui sont importants pour l'imagerie des animaux vivants. En outre, le faible coût de développement d'un système octobre a popularisé cette technique pour l'imagerie optique de spécimens. Octobre a été utilisé avec succès pour l'étude longitudinale de la drosophile. Utilisation de EAO, l'imagerie morphologique et fonctionnelle cardiaque a été réalisée pour étudier les structures cardiaques, le foncrôles additionnelles de gènes, et les mécanismes de défauts cardiovasculaires dans les modèles mutants au cours du développement cardiaque. Par exemple, le déclin de la fonction cardiaque dépendant de l' âge a été confirmée par conversion de l' angiotensine liés enzyme (ACER) gène régulé à la baisse chez la drosophile avec ^{le 27 octobre.} Phénotypage du gène lié cardiomyopathie a été démontrée chez la drosophile en utilisant ^28-33 octobre. Les recherches utilisant octobre a également révélé le rôle fonctionnel du gène SOX5 humain au cœur de Drosophila ^34. Par rapport à octobre, OCM utilise un objectif avec une ouverture numérique supérieure pour fournir une meilleure résolution transversale. Dans le passé, le dysfonctionnement cardiaque causé par silençage un gène circadien humain orthologue dCry / dclock a été étudiée en utilisant un système de OCM personnalisé ^15,16, ainsi que l'effet de la haute teneur en graisses-alimentation sur cardiomyopathies chez la drosophile pour comprendre l' obésité induite par l' homme maladies cardiaques. ¹⁵

Ici, ee protocole expérimental est résumée pour l' étude longitudinale des changements morphologiques et fonctionnels cardiaques chez la drosophile au deuxième stade (L2), troisième stade (L3), le jour de pupe 1 (PD1), le jour de pupe 2 (PD2), le jour de pupe 3 (PD3) , pupe jour 4 (PD4), le jour de pupe 5 (PD5) et adultes (Figure 1) à l' aide OCM pour faciliter l' étude des maladies cardiaques congénitales liées à l' homme. paramètres fonctionnels cardiaques, tels que les RH et la PAC ont été analysés de façon quantitative à différents stades de développement des caractéristiques cardiaques développement révéler.

Protocol

1. Préparation du système d'imagerie optique OCM de la drosophile 16 Sélectionnez un spectromètre et d' une caméra de balayage ligne à grande vitesse qui fournit un débit d'au moins 80 images / sec cadre de sorte que le système d'OCM sera en mesure de résoudre le battement de coeur de la drosophile. Utiliser une source de lumière à large bande afin d' assurer la résolution axiale de 2 um pour identifier la structure du coeur de la dros…

Representative Results

L'imagerie cardiaque longitudinale a été réalisée en utilisant les mouches des fruits avec le 24B-GAL4 / + déformation à température ambiante avec OCM. Les mesures ont été effectuées à L2, L3, et à des intervalles de 8 h de PD1 à PD4 et jour pour adultes 1 (AD1) pour suivre le processus de métamorphose (tableau 1). Larve, pupe tôt, fin pupe et les mouches adultes ont été montés sur les lames de verre comme on le voit sur la figure 1A. Les caractéristiques des segm…

Discussion

L'accélération du rythme cardiaque de la drosophile, avec un HR maximum autour de 400 bpm à des stades larvaires et adultes, exige de la vitesse élevée d'imagerie pour résoudre les diastole cardiaques et systole (pas moins de 80 images / s basé sur les expériences). En raison de la faible épaisseur de la taille de la chambre cardiaque et micron échelle paroi cardiaque (5-10 um), une résolution spatiale élevée (supérieure à 2 pm) est nécessaire pour résoudre les structures tubulaires de …

Materials

Custom OCM imaging system	Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator	Benchmark	H2200-HC
Cover glass	AmScope	200PCS
Cotton Ball	RITE AID
Instant Drosophila Formula	CAROLINA	formula 4-24
Yeast	ActiveDry
Microscope	SONY	WILD M420
Brush	Loew-Cornell	245B	being used to move specimens
Labview software	National Instruments
Image J	National Institutes of Health
Matlab	Mathworks
Tweezer	Wiha	AA SA	to fix the fruit fly wings
FlyNap	Carolina Biological Supply Company	4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M	Scotch
Pipette	Fisherbrand	MU18837
Organic Extra Coconut Oil	Spring Valley	13183
Microscope Slide	CapitolBrand	M3504-E
Drosophila Vials	SEOH	8401SS
All-trans-retinal	Sigma-Aldrich Co.	R2500