JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

מחקר אורך של הלב בחיות קטנות תורם להבנת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיות קשורות, כגון מומי לב מולד הקשורים גן 1,2. בעשורים האחרונים, במודלים של בעלי חיים שונים, כגון 3,4 עכבר, 5,6 Xenopus, 7,8 דג זברה, עופות 9, ו תסיסנית 10-16, שמש לנהל בלב-התפתחות האנושית הקשורים במחקר. מודל העכבר כבר בשימוש נרחב ללמוד התפתחות לב חריגה נורמליות פנוטיפים פגמו לב עקב הדמיון שלה עם 3,4 לב האנושי. עובר Xenopus שימושי במיוחד בחקר התפתחות לב עקב טיפולה הקל 5,6 שקיפות חלקית. השקיפות של עובר ואת הזחל המוקדם של מודל דג הזברה מאפשרת תצפית אופטית קלה של 7,8 פיתוח לב. מודל העופות הוא נושא משותף של מחקרי לב התפתחותי becausדואר בלב ניתן לגשת בקלות לאחר הסרת קליפות ביצים ואת הדמיון המורפולוגי של לבבות עופות לבני אדם 9. המודל תסיסנית יש מספר מאפיינים ייחודיים ההופכים אותו לאידיאלי עבור ביצוע מחקרים ארוכי טווח של הלב. ראשית, הצינור בלב תסיסנית הוא ~ 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח הגבה, אשר מספק נוחות עבור גישה אופטית ותצפית על הלב. בנוסף, מנגנונים מולקולריים רבים מסלולים גנטיים שמורים בין תסיסנית ובעלי החוליות. Orthologs של למעלה מ -75% מגני מחל אנושיות נמצאו תסיסנית, אשר הפכה אותו בשימוש נרחב במחקרים מהונדסים 11,13. יתר על כן, יש לו מחזור חיים קצר ועלויות תחזוקה נמוכות, ויש בו נעשה שימוש נפוץ כמודל דגימה למחקר בביולוגיה התפתחותית 14-16.

דיווחים קודמים תיאר את הפרוטוקולים לניטור תפקוד הלב תסיסנית כגון שהואArtBeat. עם זאת, תהליכים לנתיחה נדרשו 17,18. הדמיה אופטית מספקת דרך יעילה לחזות התפתחות לב בחיות בשל אופיו הלא-פולשנית. שיטות הדמיה אופטיות שונות יושמו במחקר לב חי ביצוע, כגון מיקרוסקופיה שני פוטונים 19, מיקרוסקופיה confocal 20,21, מיקרוסקופיה גיליון אור 22, ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 16,23-26. יחסית, אוק הוא מסוגל לספק עומק הדמיה גדול בלבבות חיה קטנים ללא שימוש בחומרי ניגוד תוך שמירה על רזולוציה גבוהה מהירות הדמית ultrahigh, אשר חשובה לבעלי חי הדמיה לחיות. בנוסף, העלות הנמוכה של פיתוח מערכת אוקטובר יש לפופולרי בטכניקה זו דימות אופטית של דגימות. אוקטובר שימש בהצלחה עבור מחקר אורך של דרוזופילה. באמצעות אוקטובר, הדמיה מורפולוגית ופונקציונלית לב שבוצעה כדי ללמוד את מבנה הלב, funcתפקידים תזונתיים של גנים, ואת המנגנונים של מומים קרדיווסקולרים מודלי מוטציה במהלך התפתחות לב. לדוגמא, ירידה בתפקוד לב תלוי גיל קבלה אוששה הקשורות אנזים למטה מוסדר ההמרה-אנגיוטנסין (ACER) גנים תסיסנית עם אוקטובר 27. Phenotyping של קרדיומיופתיה גנים הקשורים הודגם תסיסנית באמצעות אוקטובר 28-33. המחקר באמצעות אוקטובר חשף גם את התפקיד הפונקציונלי של גן SOX5 אדם בלב תסיסנית 34. לעומת אוקטובר, OCM משתמשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה כדי לספק רזולוציה רוחבית טוב יותר. בעבר, התפקוד לקוי הלב נגרם על ידי השתקת גני יממת אדם ortholog dCry / dClock נחקר באמצעות מערכת OCM מנהג 15,16, כמו גם את ההשפעה של דיאטה עתירה שומן על cardiomyopathies תסיסנית להבין אדם מושרה שמן מחלות לב. 15

הנה, הפרוטוקול דואר ניסוי מסוכם עבור מחקר אורך של שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים לב תסיסנית ב instar השני (L2), instar השלישי (L3), גולם יום 1 (PD1), גולם יום 2 (PD2), יום גולם 3 (PD3) גולם, יום 4 (PD4), גולם יום 5 (PD5), ומבוגרים (איור 1) באמצעות OCM להעמיק את הלימוד של מחלות לב מולדות אדם קשור. פרמטרים פונקציונלי לב, כגון משאבי אנוש CAP נותחו כמותית בשלבים התפתחותיים שונים כדי לחשוף את תכונות התפתחות הלב.

Protocol

1. הכנת מערכת OCM עבור דימות אופטי של תסיסנית 16 בחר ספקטרומטר ומצלמת קו סריקה במהירות גבוהה המספקת מסגרת בשיעור של מסגרת 80 לפחות / sec כך שמערכת OCM תוכל לפתור את פעימות הלב של דרוזופילה. <li style=";text-align:right;dire…

Representative Results

הדמיה של הלב האורך נערך באמצעות זבובי פירות עם זן 24b-GAL4 / + בטמפרטורת החדר עם OCM. מדידות בוצעו L2, L3, ובאותו 8 במרווחים hr מ PD1 כדי PD4, ומבוגר יום 1 (AD1) כדי לעקוב אחר תהליך המטמורפוזה (טבלה 1). זחל, גולם מוקדם, גולם מאוחר זבובים בוגרים היו רכובים על שקופיות הזכוכית כפי שנ?…

Discussion

קצב פעימות לב המהיר של תסיסנית, עם HR מקסימום בסביבות 400 פעימות לדקה בשלבי זחל ובוגר, דורש מהירות גבוהה הדמיה כדי לפתור את הלב diastoles ו systoles (לא פחות מ -80 מסגרות / שנייה מבוסס על חוויות). בשל עובי דופן לב בקנה מידה קאמרי לב קטן בגודל מיקרון (5 – 10 מיקרומטר), ברזולוציה מרחב?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -. T., Chang, C. -. Y., Su, M. -. T., Kuo, W. -. C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. . Laboratory culture of Drosophila. 2a, 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. . Drosophila: a laboratory handbook. , (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

Tags

Keywords: DrosophilaHeart FunctionOptical Coherence Microscopy (OCM)Cardiac DevelopmentLongitudinal ImagingIn VivoMetamorphosisGenetic SimilaritiesVertebratesOptogenetic PacingPacemaker FunctionLarva MountingDevelopmental StageHeart TubeA-scansB-scansScanner VoltageTransverse Direction
check_url/fr/55002?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image