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Biologie

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9 및 초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 심장의 광 액세스 및 관찰 편의를 제공하는 등의 표면 아래 ~ 200 μm의이다. 또한, 많은 분자 메커니즘 및 유전 경로는 초파리와 척추 동물 사이에 보존되어있다. 인간의 질환 유전자의 75 % 이상의 orthologs은 널리 유전자 연구에 사용 11,13 만든 초파리에서 밝혀졌다. 또한, 짧은 수명과 낮은 유지 보수 비용을 가지며, 일반적으로 발생 생물학 연구 14-16 검체 모델로 사용되고있다.

이전 보고서는 그 예로서 초파리 심장 기능을 모니터링하기위한 프로토콜을 묘사artbeat. 그러나, 해부 절차는 17, 18를 요구했다. 광학 이미징 인해 비 침습 자연 동물에서 심장 개발을 시각화 할 수있는 효과적인 방법을 제공합니다. 다른 광학 이미징 양식은 두 광자 현미경 (19), 공 초점 현미경 (20, 21), 빛 시트 현미경 (22), 및 빛 간섭 단층 촬영 16,23-26으로 수행 동물 심장 연구에 적용되었습니다. 비교적으로, 간섭 단층 촬영 살아있는 동물에 중요한 높은 해상도 및 초고 촬상 속도를 유지하면서, 조영제를 사용하지 않고, 작은 동물 하트 큰 촬상 깊이를 제공 할 수있다. 또한의 OCT 시스템 개발의 저비용 시험편 광학 이미징 기술이 대중화되었다. 간섭 단층 성공적 초파리의 길이 연구에 사용되었다. OCT를 심장 형태 학적 및 기능적 촬상 심장 구조를 연구하기 위해 수행 된 사용하여 FUNC적인 유전자의 역할 및 심장 개발하는 동안 돌연변이 모델에서 심장 혈관 결함의 메커니즘. 예를 들어, 연령에 따라 심장 기능의 감소는 OCT 27 초파리에서 다운 규제 안지오텐신 전환 효소 관련 (ACER) 유전자로 확인되었다. 유전자 관련 심근 병증의 표현형은 10월 28-33를 사용하여 초파리에서 입증되었다. 연구 사용 10월은 초파리 (34)의 중심에 인간의 SOX5 유전자의 기능적 역할을 한 것으로 보입니다. 간섭 단층 비해 OCM 더 가로 해상도를 제공하기 위해 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈를 사용한다. 과거에서, ortholog 인간 주기성 유전자 dCry / dClock 입을로 인한 심장 기능 장애는 비만 유도 인간 이해 맞춤 OCM 시스템 (15, 16),뿐만 아니라 초파리 심근증에 고 지방식이의 효과를 사용하여 연구되어왔다 심장 질환. (15)

여기에, 일전자 실험 프로토콜은 두 번째 령 (L2), 세 번째 령 (L3), 번데기 1 일 (PD1), 번데기 2 일 (PD2), 번데기 3 일에서 초파리의 심장 형태 학적 및 기능적 변화의 길이 방향 연구 (PD3)를 요약 , 번데기 4 일 인간과 관련된 선천성 심장 질환의 연구를 촉진하기 위해 OCM을 사용하여 (PD4), 번데기 5 일 (PD5), 성인 (그림 1). 이러한 HR 및 CAP 등 심장 기능 매개 변수를 정량적으로 심장 개발 기능을 나타 내기 위해 다른 발달 단계에서 분석 하였다.

Protocol

초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다. 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다. 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합…

Representative Results

길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 ?…

Discussion

애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
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References

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Citer Cet Article
Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
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