Drosophila Подготовка и Продольная Визуализация сердца Функция In Vivo Использование оптической когерентной микроскопии (ОКМ)

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Продольная исследование сердца у мелких животных способствует пониманию различных сопутствующих сердечно – сосудистых заболеваний человека, таких как дефекты врожденных пороков сердца , связанных с генными ^1,2. В последние десятилетия, различных животных моделях, таких как ^3,4 мыши, Xenopus ^{5,6, 7,8,} данио птичьего ⁹ и Drosophila ^10-16, были использованы для проведения человеческого сердца-разработок в области научных исследований. Модель мыши широко используется для изучения нормальных и ненормальных развития сердца и сердечные фенотипы дефектов из – за его сходства с человеческим ^3,4 сердца. Эмбрион Хепориз особенно полезен при изучении развития сердца из – за его легкой обработки и частичной прозрачности ^5,6. Прозрачность эмбриона и ранней личинки данио модели позволяет легко оптического наблюдения сердца ^7,8 развития. Птичий модель является общим предметом исследований в области развития сердца becausе сердце может быть легко доступны после удаления скорлупу и морфологическое сходство птиц сердца для людей ^9. Модель дрозофилы имеет ряд уникальных особенностей , которые делают его идеальным для выполнения продольных исследований сердца. Во- первых, сердечная трубка дрозофилы составляет ~ 200 мкм ниже дорсальной поверхности, которая обеспечивает удобство для оптического доступа и наблюдения сердца. Кроме того, многие молекулярные механизмы и генетические пути сохраняются между дрозофилы и позвоночных. В ортологи более 75% генов болезней человека были обнаружены у дрозофилы, которые сделали его широко используются в трансгенных исследованиях ^11,13. Кроме того, он имеет короткий жизненный цикл и низкие затраты на техническое обслуживание, а также был широко используется в качестве модели образца для исследования биологии развития ^14-16.

В предыдущих докладах описаны протоколы для мониторинга дрозофилы сердечной функции , такие , как онartbeat. Тем не менее, процедуры рассечение были необходимы ^17,18. Оптическая визуализация обеспечивает эффективный способ для визуализации развития сердца у животных из-за его неинвазивный характер. Различные методы оптических изображений были применены при выполнении сердца исследовании на животных, таких , как двухфотонной микроскопии ^19, конфокальной микроскопии ^20,21, световой микроскопии листа ²² и оптической когерентной томографии (ОКТ) ^16,23-26. Для сравнения, ОКТ способна обеспечить большую глубину изображения в маленьких сердцах животных без использования контрастных веществ, сохраняя при этом высокое разрешение и сверхвысокой скорости обработки изображений, которые являются важными для получения изображений живых животных. Кроме того, низкая стоимость разработки системы ОКТ популяризовал эту технику для оптической визуализации образцов. Октябре был успешно использован для продольного изучения дрозофилы. Использование Октябре, сердечная морфологическое и функциональное отображение было проведено для изучения структуры сердца, функные роли генов, а также механизмы сердечно-сосудистых дефектов у мутантных моделей во время развития сердца. Например, зависимое от возраста снижение функции сердца была подтверждена с понижающей регуляции ангиотензин-превращающего фермента , связанных с (ACER) гена у дрозофилы с ОСТ ^27. Фенотипирование кардиомиопатии связанных генов была продемонстрирована в дрозофилы с помощью ОКТ ^28-33. Исследования с использованием Октябре также выявили функциональную роль гена Sox5 человека в сердце Drosophila ^34. По сравнению с ОКТ, ОСМ использует объектив с более высокой числовой апертурой для обеспечения лучшего поперечное разрешение. В прошлом, дисфункция сердца , вызванное глушителей в ортолог человека циркадный ген dCry / dClock был изучен с помощью системы пользовательских OCM ^15,16, а также эффект с высоким содержанием жиров-диеты на кардиомиопатии у дрозофилы , чтобы понять ожирения индуцированного человека заболевания сердца. ¹⁵

Здесь йэкспериментальный протокол электронной обобщается для продольного изучения сердечных морфологических и функциональных изменений в дрозофилы на второй возрастной стадии (L2), третьей возрастной стадии (L3), куколки день 1 (PD1), куколки день 2 (PD2), куколки 3 -й день (PD3) , куколки 4 -й день (PD4), куколки день 5 (PD5) и взрослых (рис 1) с использованием OCM для облегчения изучения врожденных сердечных заболеваний человека , связанных с . Сердечные функциональные параметры, такие как HR и CAP количественно анализировали на разных стадиях развития, чтобы выявить сердечные особенности развития.

Protocol

1. Preparation of OCM System for Optical Imaging of Drosophila16 Select a spectrometer and a high-speed line scan camera that provides a frame rate of at least 80 frame/sec so the OCM system will be able to resolve the heartbeat of Drosophila. Use a broadband light source to ensure the axial resolution of 2 µm to identify the heart structure of Drosophila. Use a 10X objective to obtain a high transverse resolution. Use a 45° rod mir…

Representative Results

The longitudinal cardiac imaging was conducted using the fruit flies with the 24B-GAL4/+ strain at room temperature with OCM. Measurements were performed at L2, L3, and at 8 hr intervals from PD1 to PD4, and adult day 1 (AD1) to track the metamorphosis process (Table 1). Larva, early pupa, late pupa and adult flies were mounted on the glass slides as seen in Figure 1A. The segment features of the heart for larval and adult flies were shown in the schematic representations in Figu…

Discussion

The rapid heartbeat of Drosophila, with a maximum HR around 400 bpm at larval and adult stages, requires high imaging speed to resolve the heart diastoles and systoles (no less than 80 frames/sec based on experiences). Due to the small heart chamber size and micron scale heart wall thickness (5 – 10 µm), a high spatial resolution (better than 2 µm) is required for resolving the heart tube structures. In this study, a high resolution and ultrahigh speed OCM system was developed, where a spectrometer wit…

Materials

Custom OCM imaging system	Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator	Benchmark	H2200-HC
Cover glass	AmScope	200PCS
Cotton Ball	RITE AID
Instant Drosophila Formula	CAROLINA	formula 4-24
Yeast	ActiveDry
Microscope	SONY	WILD M420
Brush	Loew-Cornell	245B	being used to move specimens
Labview software	National Instruments
Image J	National Institutes of Health
Matlab	Mathworks
Tweezer	Wiha	AA SA	to fix the fruit fly wings
FlyNap	Carolina Biological Supply Company	4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M	Scotch
Pipette	Fisherbrand	MU18837
Organic Extra Coconut Oil	Spring Valley	13183
Microscope Slide	CapitolBrand	M3504-E
Drosophila Vials	SEOH	8401SS
All-trans-retinal	Sigma-Aldrich Co.	R2500