Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Longitudinell studie av hjärtat i små djur bidrar till att förstå ett flertal humana relaterade kardiovaskulära sjukdomar, såsom gen relaterade medfödda hjärtfel 1,2. Under de senaste decennierna, olika djurmodeller, såsom mus 3,4, Xenopus 5,6, zebrafisk 7,8, avian 9, och Drosophila 10-16, har använts för att genomföra det mänskliga hjärtat utveckling relaterad forskning. Musmodellen har använts i stor utsträckning för att studera normal och onormal hjärt utveckling och hjärtfel fenotyper på grund av dess likheter med människans hjärta 3,4. Xenopus embryon är särskilt användbar i studiet av hjärtutveckling på grund av dess enkel hantering och delvis genomskinlighet 5,6. Öppenheten i embryot och tidig larv av zebrafisk modellen möjliggör enkel optisk observation av hjärt utveckling 7,8. Fågel modellen är en vanlig föremål för utvecklingshjärtstudier because hjärtat kan lätt nås efter avlägsnande av äggskal och morfologiska likheten mellan fågel hjärtan för människor 9. Drosophila modellen har vissa unika egenskaper som gör den idealisk för att utföra longitudinella studier av hjärtat. Först, är hjärtat rör av Drosophila ~ 200 pm under den dorsala ytan, vilket ger bekvämlighet för optisk access och observation av hjärtat. Dessutom är många molekylära mekanismer och genetiska vägar konserverade mellan Drosophila och ryggradsdjur. De ortologer på över 75% av sjukdomsgener mänskliga påträffades i Drosophila, som har gjort det ofta används i transgena studier 11,13. Dessutom har det en kort livscykel och låga underhållskostnader, och har ofta används som ett prov modell för utvecklingsbiologisk forskning 14-16.
Tidigare rapporter beskrev protokoll för övervakning av Drosophila hjärtfunktioner såsom hanArtbeat. Emellertid var dissektion förfaranden krävs 17,18. Optisk avbildning ger ett effektivt sätt att visualisera hjärt utveckling hos djur på grund av dess icke-invasiva natur. Olika optiska avbildningsmetoder har använts för att utföra djur hjärtstudie, såsom två-foton mikroskopi 19, konfokalmikroskopi 20,21, ljus ark mikroskopi 22, och optisk koherens tomografi (OCT) 16,23-26. Jämförelsevis, är oktober kan tillhandahålla stor bilddjupet i små djur hjärtan utan att använda kontrastmedel, samtidigt som en hög upplösning och en ultrahög utskriftshastighet, som är viktiga för att avbilda levande djur. Dessutom har den låga kostnaden för att utveckla ett oktober-system populariserade denna teknik för optisk avbildning av prover. Oktober har framgångsrikt använts för longitudinell studie av Drosophila. Använda oktober, har hjärt morfologiska och funktionella avbildnings utförts för att studera hjärtstrukturer, funktionella roller gener, och mekanismerna för kardiovaskulära defekter i muterade modeller under hjärt utveckling. Till exempel var åldersberoende hjärtfunktion nedgång bekräftas med nedregleras angiotensin converting enzyme relaterade (ACER) gen i Drosophila med 27 oktober. Fenotypning av genen relaterad kardiomyopati visades i Drosophila använder oktober 28-33. Forskning med hjälp av oktober avslöjade också den funktionella rollen av mänsklig SOX5 genen i hjärtat av Drosophila 34. Jämfört med oktober, använder OCM ett mål med en högre numerisk bländare för att ge bättre tvär upplösning. I det förflutna, har hjärtat dysfunktion orsakad av att tysta en ortolog human dygnsrytm gen dCry / dclock studerats med hjälp av en anpassad OCM systemet 15,16, liksom effekten av fettrik-diet på kardiomyopatier i Drosophila att förstå fetma inducerad human hjärtsjukdomar. 15
Här, the försöksprotokoll sammanfattas för longitudinell studie av hjärt morfologiska och funktionella förändringar i Drosophila på andra stadiet (L2), tredje stadiet (L3), puppa dag 1 (PD1), puppa dag 2 (PD2), puppa dag 3 (PD3) , puppa dag 4 (PD4), puppa dag 5 (PD5), och vuxna (figur 1) med hjälp av OCM för att underlätta studier av medfödda hjärtsjukdomar människorelaterade. Hjärt funktionella parametrar, såsom HR och CAP analyserades kvantitativt vid olika utvecklingsstadier för att avslöja de kardiella utvecklingsfunktioner.
Den snabba hjärtslag Drosophila, med en maximal HR runt 400 bpm på larv och vuxenstadier, kräver hög utskriftshastighet för att lösa hjärt diastoler och systoler (inte mindre än 80 bilder / sek baserad på erfarenheter). Grund av den lilla hjärtkammaren storlek och mikron skala hjärtväggtjocklek (5-10 ^ m), en hög rumslig upplösning (bättre än 2 ^ m) krävs för att lösa hjärt rörstrukturer. I denna studie var en hög upplösning och ultrahög hastighet OCM system utvecklat, där en spektromet…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |