Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploïdie waargenomen niet alleen in gespecialiseerde weefsels van zoogdieren maar ook in een verscheidenheid van pathologische aandoeningen, zoals kanker en degeneratieve ziekten. Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels, zoals de oesophagus of 1,2 squameuze intra-epitheliale laesies van de cervix 3,4 Barrett's en werden beschouwd als de bron van kwaadaardige aneuploïde cellen in deze weefsels 5 , 6. Ofschoon wordt voorgesteld omzetting van tetraploïde tot aneuploïde cellen een belangrijke gebeurtenis in de vroege stadia van tumorigenese kan zijn, worden de hierbij betrokken mechanisme niet volledig begrepen. Dit komt deels omdat er geen in vitro model beschikbaar is geweest, waar niet-getransformeerde polyploïde menselijke cellen kunnen voortplanten.
Sommige onderzoekers hebben veroorzaakt tetraploidy in niet-getransformeerde humane epitheelcellen door de generatie van binucleaire cellen door inhibiting cytokinese 7-9. Bij deze werkwijze echter onnodig diploïde cellen geëlimineerd worden door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 7,8 of kloneren door beperkende verdunning 9. Omdat deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren, eenvoudigere methoden voor het vaststellen getransformeerde tetraploïde cellen gewenst voor onderzoek op dit gebied.
In dit rapport beschrijven we een protocol om proliferatieve tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten of-telomerase onsterfelijk gemaakte humane fibroblasten vast te stellen door een relatief eenvoudige procedures. De procedures spil poison demecolcine (DC) aan diploïde cellen in mitose, en mitotische cellen door afschudden worden verder behandeld met DC verzameld arresteren. Diploïde mitotische cellen behandeld met DC voor langere tijd om te zetten in tetraploïde G1 cellen en deze cellen zich vermenigvuldigen als tetraploïde cellen na groeistop voor enkele dagen na verwijdering drug. Dit protocol biedteen efficiënte methode voor het maken van een bruikbaar model om de relatie tussen chromosomale instabiliteit en het oncogene potentieel van polyploïde menselijke cellen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een groot probleem bij inductie van tetraploidy uit diploïde cellen door chemische middelen, door cytokinese remmers of spindel remmers, is dat cellen vaak een mengsel van diploïde en tetraploïde bevolkingen en tetraploïde cellen moeten worden gescheiden van diploïde cellen. De meest voorkomende methoden voor het isoleren van een tetraploïde bevolking vrij van diploïde cellen gebruiken FACS of het klonen door beperkende verdunning. Echter, deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren. In dit …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
