Xenopus Oocyter: optimerade metoder för mikroinjektion, Borttagning av Follikulära cellager, och snabb lösning Förändringar i Elektro Experiment
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
Xenopus-oocyt som en heterolog expressionssystem för proteiner, beskrevs först av Gurdon et al. 1 och har i stor utsträckning använts sedan dess upptäckt (Referenser 2 – 3, och referenser däri). En egenskap som gör ägget attraktivt för utländska kanal uttryck är dålig överflöd av endogena jonkanaler 4. Detta expressionssystem har visat sig vara användbara för karakterisering av många proteiner, bland dem ligandreglerade jonkanaler.
Uttrycket av GABA A-receptorer i Xenopus oocyter och deras funktionell karakterisering beskrivs här, inklusive isolering av oocyter, microinjections med cRNA, avlägsnande av follikulära cellskikt, och snabba förändringar lösning i elektrofysiologiska experiment. Procedurerna optimerades i detta laboratorium 5,6 och avviker från de rutinmässigt används 7-9. Traditionellt är blottlagda oocyter framställesmed en långvarig kollagenas behandling av äggstocks lober vid RT, och dessa avklädda oocyter injiceras med mRNA. Med hjälp av optimerade metoder har olika membranproteiner uttryckts och studerade med detta system, såsom rekombinanta GABA A-receptorer 10-12, humana rekombinanta kloridkanaler 13, trypanosominfektion kaliumkanaler 14 och en myo-inositol transportör 15, 16.
De metoder som beskrivs här kan tillämpas på uttrycket av vilket protein som helst av val i Xenopus-oocyter, och snabb förändring av lösningen kan användas för att studera andra ligandreglerade jonkanaler.
Introduction
Xenopus-oocyter används allmänt som ett expressionssystem (Referenser 2 – 3, och referenser däri). De är kapabla att korrekt montera och införliva funktionellt aktiva multisubunit proteiner i deras plasmamembran. Med användning av detta system är det möjligt att funktionellt undersöka membranproteiner enbart eller i kombination med andra proteiner, för att studera egenskaperna hos muterade, chimära eller sammanlänkas proteiner, och för att screena potentiella läkemedel.
Fördelarna med att använda oocyter framför andra heterologa expressionssystem innefattar den enkla hanteringen av jätteceller, den höga andelen av celler som uttrycker främmande genetisk information, den enkla kontrollen av miljön av oocyten med hjälp av bad perfusion, och kontrollen av membranpotentialen .
Nackdelen med detta uttryckssystem är den säsongsvariation som observerats i många laboratorier 17-20. Anledningen till denna variationär långt ifrån klart. Dessutom är kvaliteten på ägg ofta observerats variera kraftigt. Traditionella metoder 7-9 har inkluderat isolering av äggstocks lober, exponeringen av äggstocks lober till kollagenas för några timmar, valet av blottlagda oocyter, och äggcellen mikroinjektion. Här finns ett antal alternativ, snabba förfaranden rapporterade att ha tillåtit oss att arbeta med detta uttryckssystem för mer än 30 år utan säsongsvariation och lite variation i äggcellen kvalitet.
De modifierade och förbättrade metoder som beskrivs här för isolering av oocyter, mikroinjektion med cRNA, och avlägsnande av follikulära cellskikt kan användas för att uttrycka något protein val i Xenopus äggcellen. Den mycket enkel metod för snabba förändringar av mediet runt oocyten lösning kan appliceras på studien av något ligandstyrda jonkanaler och transportörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs i denna artikel avvika från de som används traditionellt 09/07. Det är standard att exponera lober äggstockarna till en 1-2 h kollagenas behandling 8; isolera oskadade, avklädda oocyter; och injicera dem med mRNA med hjälp av injektions kommersiella enheter. Denna klassiska förfarande har följande nackdelar: 1) Oocyter kan komma att skadas av lång exponering för höga koncentrationer av kollagenas. 2) De instabila avklädda oocyter måste lagras tills experimentet….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
