Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1 ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları 4 kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
GABA A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda 5,6 optimize edilmiş ve rutin 7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT'de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA A reseptörleri 10-12, insan rekombinant klorür kanalları 13, tripanosom potasyum kanallarının 14 ve miyo -inositol taşıyıcı 15, 16 olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir.
Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür.
başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oositin bir ortamda kolayca kontrol eksprese eden hücrelerin yüksek oranda ve membran potansiyelinin kontrolü, .
Bu ifade sisteminin dezavantajı birçok laboratuvarda 17-20 gözlenen mevsimsel çeşididir. Bu varyasyon nedeninet olmaktan çok uzaktır. Buna ek olarak, oosit kalitesi genellikle güçlü bir değişiklik gözlenmiştir. Geleneksel yöntemler 7-9 yumurtalık loblar izolasyonunu, bazı saat kollajenaz için yumurtalık lobların pozlama, soyulmuş oosit seçimi ve oosit mikroenjeksiyon dahil ettik. Burada, alternatif, hızlı prosedürlerin bir dizi bize oosit kalitesinde mevsimsel değişimi ve küçük farklılıklar ile 30 yılı aşkın için bu ifade sistemi ile çalışmak için izin olduğunu bildirildi.
Oosit izolasyonu, mikro enjeksiyon cRNA ile ve foliküler hücre tabakası çıkarılması için anlatılan tadil edilmiş ve geliştirilmiş yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için kullanılabilir. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı ve taşıyıcıların çalışmaya uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel 7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi 8 yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit kökle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
