Ce protocole fournit une méthode pour la collecte de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) de moyenne Climatisé (MESC-CM) dérivé de sérum (sérum fœtal bovin, FBS) - et d'alimentation (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) conditions sans gluten pour une cellule approche -free. Il peut être applicable pour le traitement du vieillissement et de maladies associées au vieillissement.
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Article de méthode
Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule
Dans cet article
Résumé
Résumé
La capacité des cellules souches embryonnaires (CSE) et des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à générer divers types de cellules a ouvert de nouvelles voies dans le domaine de la médecine régénérative. Cependant, malgré leurs avantages, le potentiel tumorigène des CSE et des CSPi a longtemps été un obstacle pour les applications cliniques. Il est intéressant de noter qu’il a été démontré que les CSE produisent plusieurs facteurs solubles qui peuvent favoriser la régénération des tissus et retarder le vieillissement cellulaire, ce qui suggère que les CSE et les CSPi peuvent également être utilisées comme méthode d’intervention acellulaire. Par conséquent, la méthode de récolte d’un milieu conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris (mESC-CM) avec une contamination minimale des composants sériques (sérum fœtal bovin, FBS) et des cellules nourricières (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) a été fortement demandée. Ici, la présente étude démontre une méthode optimisée pour la collecte de mESC-CM dans des conditions sans sérum et sans mangeoire, et pour la caractérisation de mESC-CM à l’aide de lectures multiples associées à la sénescence. Ce protocole fournira une méthode pour collecter des facteurs sécrétoires spécifiques des CSEm purs sans contamination du sérum et des mangeoires.
Introduction
L'objectif de ce protocole est de recueillir des souris embryonnaires cellules souches (MESC) moyenne Climatisé (MESC-CM) à partir des conditions de culture sans sérum et sans alimentation et de caractériser ses fonctions biologiques.
En général, les cellules souches embryonnaires (CSE) ont un grand potentiel pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire en raison de leur pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement 1-3. Cependant, la transplantation directe de cellules souches a plusieurs limitations, telles que le rejet immunitaire et la formation de tumeurs 4,5. Par conséquent, une approche ....
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Protocole
REMARQUE: Un schéma du sérum et le protocole de collecte de CM sans chargeur-est représenté sur la figure 1.
1. Matériaux (Préparation du MEF, Medium, Plaques et Solutions)
- Préparer 500 ml de milieu de culture les MEF. Supplément milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de FBS (qualité ESC), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine.
- Isoler MEFs à partir d' embryons suivant un protocole de routine établie 13 et les maintenir dans le milieu MEF.
- Préparer 500 ml de milieu pour la culture des mESCs. DMEM est complété avec 15% de FBS et 2 mM de L-glutamine, de 100 um d&#....
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Résultats
A l' origine, mESCs sont maintenus sur un dispositif d' alimentation en milieu MEF MESC avec du FBS et d' autres suppléments (Figures 1A et 2A). CM ont été recueillies auprès de mESCs réduit Sérum médias sans couche d'alimentation, FBS, ou d' autres suppléments (figures 1B et 2B). Cette condition de culture nous permet de recueillir MESC spécifique milieu conditionné sans contamination potentielle par.......
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Discussion
Pour le succès de la collecte de sérum et de MESC-CM sans alimentation, les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Le facteur le plus important est l'utilisation précoce mESCs de passage pour la collecte des MESC-CM. Auparavant, il a été montré que le passage précoce MESC-CM a de meilleurs effets anti-âge par rapport à mESCs de passage tardif. Le nombre de passage mESCs a été rapporté à affecter leur potentiel de développement 16 et 17 pluripotence.
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par le programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A2060930) et le Programme Medical Research Center (2015R1A5A2009124) par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future. Cette recherche est également soutenu par un démarrage Subvention de fonctionnement de The Hospital for Sick Children (HK Sung). Nous tenons à remercier Laura Barwell et Sarah JS Kim pour leur excellente aide à la rédaction de ce manuscrit et le Dr Andras Nagy pour fournir la ligne G4 MESC.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20 %, ES de qualité cellulaire |
| Pénicilline et streptomycine | Invitrogen | #15140 | 50 unités/ml de pénicilline et 50 ; mg/ml streptomycine |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 ; mM |
| Acides aminés non essentiels (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 ; et micro ; M |
| &beta ;-mercaptoéthanol ; | Sigma | #M3148 | 100 ; et micro ; |
| M Facteur inhibiteur de la leucémie ; | Millipore | #ESG1107 | 100 unités/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal ; | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3,70 % |
| Diméthylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Ferricyanure de potassium | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| Ferrocyanure de potassium | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycine C | Sigma | #M4287 | 10 ; et micro ; g/ml |
| Iodure de propidium ; | Sigma | #P4170 | 50 ; et micro ; g/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix ; | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast ; | LONZA | #CC-2511 | |
| Filtre pour bouteille | Corning | #430513 | 0.2 &mu ; L |
Références
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
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Réimpressions et autorisations
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