خلية خالية من الحمض النووي تحليل النزاهة في عينات البول
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
على الرغم من وجود تعميم الحمض النووي خالية من الخلايا في البلازما أو مصل وقد تبين على نطاق واسع أن تكون مصدر مناسب من المؤشرات الحيوية لأنواع عديدة من السرطان، وركزت بعض الدراسات على إمكانية استخدام (UCF) الحمض النووي البول خالية من الخلايا. بدءا من الفرضيات أن الخلايا أفكارك العادية تنتج الحمض النووي مجزأة للغاية وأن الخلايا السرطانية الإفراج أطول الحمض النووي، والدور المحتمل للUCF سلامة الحمض النووي تم تقييم باعتباره علامة التشخيص المبكر قادرة على التمييز بين المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا أو المثانة والأفراد الأصحاء.
ويقترح تحليل سلامة UCF الحمض النووي على أساس أربعة تقارير إنجاز المشروعات في الوقت الحقيقي الكمية من أربعة سلاسل أطول من 250 سنة مضت: ج-MYC، BCAS1، HER2، وAR. وقد تم اختيار تسلسل أن يكون في كثير من الأحيان زيادة عدد نسخ الحمض النووي في المثانة وسرطان البروستاتا لتحليل، ولكن الأسلوب هو مرن، ويمكن أن تكون بديلا هذه الجينات مع جينات أخرى من الأسواق العالمية ضغطهاراحة. وقد تم بالفعل أظهرت إمكانية الاستفادة من UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للالأورام الخبيثة المسالك البولية، مما يمهد الطريق لمزيد من الدراسات حول توصيف UCF الحمض النووي. وUCF اختبار سلامة الحمض النووي لديها ميزة كونها غير الغازية، سريعة، وسهلة لأداء، مع عدد قليل فقط ملليلتر من البول اللازمة لإجراء التحليل.
Introduction
يمكن الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم والبول نتيجة لموت الخلايا عن طريق آليات أفكارك أو الميتة. الحمض النووي خالية من الخلايا في الدم وقد درس على نطاق واسع لأغراض التشخيص والنذير في مختلف الأمراض، خاصة سرطان 1. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن دور (UCF) الحمض النووي البولية خالية من الخلايا. UCF الحمض النووي قد تنشأ من مرور الدم من خلال نظام الترشيح الكبيبي أو من الخلايا التي تأتي مباشرة في اتصال مع هذه السوائل في الجسم 2 (على سبيل المثال، خلايا الظهارة البولية أو خلايا البروستاتا). بصورة رئيسية تم التحقيق في استخدام UCF الحمض النووي كمصدر من المؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر للالكلى والمثانة، وسرطان البروستاتا ويرجع ذلك إلى نسبة عالية من الحمض النووي UCF القادمة مباشرة من خلايا المسالك البولية 3،4.
لا يعرف الكثير عن UCF الحمض النووي وأفضل الطرق لعزل وتوصيف ذلك. وبالنظر إلى فرضية أن الخلايا السرطانية تطلق شظايا الحمض النووي أطول من الخلايا الطبيعية، وتقييمالنزاهة الحمض النووي خالية من الخلايا وقد درس في محاولة لإلقاء الضوء على أصل الحمض النووي في الدورة الدموية 5. وقد أظهرت بعض الدراسات أن خالية من الخلايا سلامة الحمض النووي في الدم تمثل اختبارا جيدا لأنواع عديدة من السرطان 6 التشخيص، وقد اقترحت نفس الفرضية فيما يتعلق البول 7-9.
وتصف هذه الورقة طريقة جديدة لتحليل سلامة UCF الحمض النووي مع التطبيق المحتمل لكشف المثانة وسرطان البروستاتا. على وجه الخصوص، وسلامة UCF الحمض النووي شظايا تم اختبار أطول من 250 نقطة أساس في 4 مناطق المعروف أن زيادة عدد نسخ الحمض النووي في الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان البروستاتا وسرطان المثانة: ج-MYC (8q24.21)، HER2 (17q12.1 )، BCAS1 (20q13.2)، وAR (Xq12) 10-14. والجينات المسرطنة محددة، بدلا من تسلسل عشوائي المختار، لزيادة احتمال العثور عليهم في جزء خالية من الخلايا لمرضى السرطان. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه مرن ويمكن أيضا اختيار أن المناطق الأخرى على أساس نوع الورم وخصائصها.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF تحليل سلامة الحمض النووي هو أسلوب جديد، غير الغازية لتقييم سلامة الحمض النووي في البول. واقترح مؤخرا انها لتشخيص مبكر من المثانة (9) وسرطان البروستات 7،8. وتناقش عدد من مزايا وعيوب اختبار سلامة UCF الحمض النووي هنا، جنبا إلى جنب مع آفاق المستقبل.
<p class="jove_…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
