Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

За последние несколько десятилетий, внеклеточный матрикс (ECM) стала признана разнообразной, динамичной и сложной среде, которая участвует в нескольких клеточных физиологических и патологических процессов. На тканевом уровне, ЕСМ влияет на передачу сигналов клетки, моторику, дифференциацию, ангиогенез, биологии стволовых клеток, туморогенез, фиброз и т.д. ^1,2. Изучение организации ECM и ECM-зависимых процессов, таким образом, имеет широкие последствия для клеточной биологии и физиологии тканей. Для того, чтобы достичь понимания механистической состава ECM, организации и функциональных свойств, методы точного выделения ECM требуется. В то время как ранние идентификации белков ЕСМ , на которые ссылается изоляции из тканей ^3, подготовка ЕСМ из культивируемых клеток теперь стало более распространенным.

Выделение и анализ клеток, полученных ECM является сложным по двум основным причинам. Во-первых, наличие клеток иИК обильные внутриклеточными белками может сделать его трудно выделить ECM как дискретная внеклеточной структуры. В самом деле, некоторые белки ЕСМ имеют определенные функции внутри клетки, а также в ECM ^4; Таким образом, эффективное удаление внутриклеточных белков из клеточного происхождения ECM имеет жизненно важное значение, если исследование белков в ECM не следует путать с их ролями внутри клетки. Во-вторых, полученной из культур клеток ЕСМ состоит из множества больших, олигомерных белков, которые часто ковалентно сшиты при сборке ECM и, таким образом, нерастворимый в стандартных моющих средств. Эти свойства могут усложнить извлечение и дальнейший анализ ECM. Для решения этих проблем, метод необходим, что позволяет эффективное разделение белков ЕСМ от клеточных компонентов.

Существует несколько методов, были описаны в литературе для выделения ЕСМ из любой культуры клеток или тканевых экстрактах. Многие из этих методов направлены на добычу обильной ECM прotein, коллаген, из тканей и включают в себя использование нейтральных солей, ³ кислых условиях ^5,6, или пепсин ^7. Выделение общего ЕСМ из экстрактов тканей часто включает в себя decellularization ткани до выделения ЕСМ. Так , например, способ экстракции последовательным было описано , что изолирует ЕСМ из сердечной ткани человека ^8. Во-первых, слабо связанных белков ЕСМ экстрагировали 0,5 М NaCl до того додецилсульфат натрия (SDS) использовали для удаления клеток. Наконец, оставшиеся белки ECM были извлечены с использованием 4 М гуанидин ^8. ECM также могут быть растворены из decellularized образцов с использованием 8 М мочевины ^9. Другие методы используют моющие средства, такие как деоксихолевая кислота ^10, чтобы извлечь обе клетки и ECM перед отделением нерастворимых белков ЕСМ из растворимых клеточных лизатов центрифугированием.

Способ выделения и анализа клеток, полученных ECM, описанной в настоящем докладе, предоставляет репроприводима способ удаления клеточного материала, в результате чего полученный из клеток ЕСМ , который может быть проанализирован на месте иммунофлюоресценции или извлеченный для дальнейшего биохимического анализа. Этот метод может быть адаптирован для любого прилегающего типа клеток и могут быть расширены для последующих процедур, таких как иммуноблоттинг или масс-спектрометрии, или для использования изолированного ECM в функциональных исследований. Способ также может быть использован в сочетании с конфокальной микроскопии живых клеток для отслеживания ЕСМ осаждения в помеченный белка в режиме реального времени. Это достигается за счет использования с сеткой, со стеклянным дном тарелки. В целом, подход обеспечивает точное выделение клеток, полученных ECM, а также сферу для выявления и мониторинга осаждения и динамики отдельных белков ECM.

Protocol

1. Удаление клеток с гидроокись аммония раствора Подготовка адгезивных клеток путем высева на соответствующей плотности. Примечание: Ячейки могут быть любой приверженец тип клеток, который производит достаточное количество ECM для анализа. Здесь мы опишем использование COS-7 клеток, африканской зеленой мартышки почки фибробластоподобных клеточной линии, которая содержит SV-40 вирусных последовательностей ДНК; RCS, крыса Хондросаркома клеточная линия; или нормальный человек кожная фибробластов (HDF) штаммов из несовершеннолетних крайней плоти. HDF используются из прохода 1 только проход 8. Пластина клеток на покровные для визуализации живых клеток и ECM, для флуоресцентной микроскопии исследования фиксированной ECM, или для получения клеток, полученных ECM для небольших функциональных анализов. Пластина клеток на чашки для культивирования клеток для анализа SDS-PAGE, иммуноблот или протеомики исследований. Примечание: Условия культивирования клеток (количество клеток к пластине и культуральной среды) будет зависеть от типа клеток. Число клеток к пластине необходимо будетбыть установлены эмпирически для конкретной линии клеток или клеточного штамма. Дайте подходящее время для клетки для осаждения ECM, обычно> 16 ч. Примечание: Период времени будет зависеть от типа клеток и должны быть определены эмпирически. Если проведение эктопической экспрессии, позволяют подходящее время для экспрессии трансфицированных белка, представляющего интерес, и для осаждения ECM. В вытяжным зонтом, Готовят 20 мМ гидроокись аммония в подходящем сосуде разбавлением маточного раствора 1/14 деионизованной H 2 O. Удалить клетки из инкубатора и аккуратно удалить культуральную среду. Добавить фосфатно-солевой буфер (PBS) без Са 2+ / Mg 2+, осторожно наливая к стенкам посуды. Rock блюдо в два раза, и удалить жидкость с пластиковой пипетки передачи. Повторите два раза больше. В вытяжным зонтом, наклонять каждое блюдо и удалить PBS с шага 1.2 с пластиковой пипетки передачи. Добавить 3мл гидроксида аммония на 100-мм чашку и инкубировать их при комнатной температуре в течение 5 мин. В течение 5-минутного периода инкубации, осторожно перемешивайте блюдо каждые мин, чтобы обеспечить лизис всех клеток. Шаги 1.4-1.7 будут также проводиться в вытяжкой. Примечание: удаление Альтернативный клеток реагенты включают 2 М или 8 М мочевины, которые инкубируют с клетками в течение 10 мин. Добавьте обильное количество деионизованной H 2 O в каждую чашку, по меньшей мере , 20 мл на 100 мм блюдо с качалки. Утилизацию аммония гидроксид солюбилизированный материал, который состоит из гидроксида аммония, лизированных клеток и деионизованной H 2 O-аспирации с пипетки передачи. Перенесите этот раствор отходов в контейнер для жидких отходов. Промыть нерастворимый ECM слой в обильной деионизованной H 2 O еще четыре раза , чтобы обеспечить полное удаление всех аммония гидроксида солюбилизированных материала. Для осмотра ECM с помощью иммунофлуоресценции, исправить ECM добавлением 2%параформальдегидом (ПФА; 3 мл на 100 мм чашку) при комнатной температуре в течение 10 мин. Внимание: PFA очень опасно в случае кожи или контакта глаз и тяжелой передержки может производить повреждение легких, удушье, потеря сознания или смерть. Он должен быть обработан только в вытяжным зонтом, и средства индивидуальной защиты следует носить. Промыть каждый фиксированный образец дважды PBS, как на стадии 1.2, и распоряжаться раствором PFA в подходящую емкость жидких отходов. При необходимости хранить образцы ECM в PBS при 4 ° С до подготовки их для флуоресцентной микроскопии. 2. Отслеживание Отложение ЕСМ белка конфокальной микроскопией изображений живых клеток Граф клеток под гемоцитометра. Для клеток COS-7, пластины 250000 клеток на 60 мм для культивирования клеток на чашку для трансфекции. Примечание: Для получения изображений живых клеток, клетки должны быть трансфицированы вектором, кодирующим ECM белок, представляющий интерес, слитый в рамке с генетически закодированного флуоресцироватьнт тег. Это для того, чтобы идентифицировать ECM интерес белка во время живых клеток. После подходящего времени для экспрессии белка (например, 16 ч) удаления клеток из сосуда с раствором трипсин-ЭДТА, сосчитать их в гемоцитометра, и пластинчатые ~ 150000 клеток на 35-мм с сеткой, со стеклянным дном тарелки для работы с изображениями. Дождать 2 ч для клеток и снова прикрепить начать отложение ECM (период времени будет зависеть от типа клеток и должны быть установлены эмпирически). ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду клеток, которая не содержит фенол красный, так как это может дать красный оттенок, который влияет на качество изображения. В течение более 2 – часового периода, установить конфокальной микроскопии с температурой 37 ° С в инкубаторе камере и подачи СО 2. Дайте температуры в камере и в чашке, чтобы стабилизировать до 37 ° С до обработки изображений; это может занять до 1 часа. Инкубируйте клетки высевали на 35 мм с привязкой к сетке блюдо с флуоресцентным маркером клеток в течение 30 мин. Затем промыть клеткидважды в фенолового красного культуральной среде перед визуализации. Примечание: цитоплазматический флуоресцентный маркер можно использовать для визуализации объемов клеток, или с мембраной включения маркер может использоваться для визуализации края ячейки. Использование цели 20X и фазового контраста на конфокальной микроскопии, определить соответствующий квадрат сетки, которая содержит ряд (> 3) единомышленником, здоровые клетки. Подтверждение экспрессии белка-мишени выбора в клетках в пределах выбранного квадрата сетки с использованием целей 63x или 100x и соответствующие длины волн под флуоресцентной микроскопии. Настройка флуоресценции и фазового контраста покадровой обработки изображений с помощью программного обеспечения Z-стека. Установите "Begin" стек, чтобы быть чуть ниже ECM слоя и "End" стек, чтобы быть чуть выше тела клетки. Установить размер Z-шага до 0,3 мкм и Z-громкости между 5 и 10 мкм глубины в общей сложности, в зависимости от типа клеток. Это даст между 15-30 г сечений в момент времени. Capturе флуоресценции (для красного флуоресцентного белка (RFP), возбуждения = 555 нм и эмиссии = 584 нм) и фазового контраста изображений периодически в течение определенного периода времени. Например, можно использовать программное обеспечение покадровой установить интервал времени, через 2 мин и продолжительность до 2 ч. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать захват Z-секции изображений в течение определенного периода времени. В конце периода времени, следует извлечь клетки из тарелки, как описано в пунктах 1.1-1.5, чтобы подтвердить локализацию флуоресцентно-меченого белка в ЕСМ. С помощью фазового контраста изображений и цель 20X переместить соответствующий квадрат сетки. Переход к цели 63x и идентифицировать ECM слой под флуоресцентным микроскопом. Сравните это изображение с изображением предварительной экстракции 3. Стерильный Получение клеточного происхождения ECM для сотовых функциональными пробами Вырастить одну популяцию клеток (далее "производитель матрица" клетки) на покровных и другой попусоотношение ( «ТЕСТ» клеток) в стандартной культуре в 100 мм для культивирования клеток блюдо в течение по крайней мере 24 часов. ПРИМЕЧАНИЕ: Это могут быть любые два различных прилипшие типов клеток, а также экспериментальная конструкция может включать в себя трансфекцию популяций одного или обоих клеток для экспрессии флуоресцентно-меченого белка ECM. В ламинарном потоке, который используется для культивирования клеток, готовят стерильные растворы PBS без Са 2+ / Mg 2+, 20 мМ гидроксида аммония (этап 1.3), и деионизированная H 2 O при прохождении каждого через стерильный 0,2 фильтр мкм в соответствующий стерильный контейнер. Поддержание стерильной техники, аккуратно мыть "производитель матрицы" клетки на покровных три раза стерильной PBS (этап 1.2). Удалите PBS путем аспирации с помощью стерильной пипетки и утилизировать его в подходящую емкость жидких отходов. Добавить 20 мМ гидроксида аммония (стерильный 3 мл / 100 мм блюдо) и инкубировать их в течение 5 мин с качалки интервалами. Добавить обильноестерильной деионизованной H 2 O в "продуцент матрица" блюдо, по меньшей мере , 20 мл на 100 мм блюдо, с качалки и вылить лизата клеток в подходящий контейнер для отходов. Повторите шаг 3,5 еще четыре раза, чтобы обеспечить полное удаление аммония гидроксида солюбилизированных материала. ПРИМЕЧАНИЕ: ECM депонируются "производитель матрицы" клеток на покровные затем обеспечивает стерильную ECM для функциональных анализов с любыми тестируемых клеток, представляющих интерес. Инкубируйте тестовые клетки из клеток фондовой блюдо с 1,5 мл трипсин-ЭДТА раствора на мм чашку 100 (0,05% вес / об трипсина и 0,02% вес / объем ЭДТА в сбалансированном солевом растворе Хэнкса), пока тест-клетки не отделяются от тарелки , Добавить клеточную среду, центрифугировать тестовые клетки при 400 мкг в течение 5 мин, и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируют испытательные камеры в свежей, стерильной среде и считать их в гемоцитометра. Пластинчатые соответствующее количество этих тестовых клеток на стерильном, изолированных ECM на coversliпс. Культура их в соответствующей среде клеток в течение 2-3 ч, или в течение периода времени, необходимого для эксперимента. Изучить организацию актинового цитоскелета, зафиксировать тестовые клетки в 2% PFA и окрашивают их с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -phalloidin (возбуждение = 490 нм и излучение = 525 нм) для визуализации F-актин и с 4 ', 6 -diamidino-2-фенилиндола (DAPI; возбуждения = 358 нм и эмиссии = 461 нм) для визуализации ядер 11. Примечание: Сравнение морфологии и организации актина в тестируемых клеток высевали на гетерологичных клеток, полученных ECM с тестируемыми клетками высевают на их собственном ЕСМ. 4. Выделение ECM для SDS-PAGE, иммуноблот анализ, или протеомика Расти прилипшие клетки, представляющие интерес на 100 мм чашки для культивирования клеток (от 5 до 10 блюд для протеомики или 1-2 блюда для иммуноблоттинга) в течение 24-96 ч, в зависимости от обстоятельств для данного типа клеток, чтобы обеспечить секрецию и отложение ECM. Удалить клетки как Described с шагом 1,1-1,5. Наклон каждой пластины под углом к стечь остаткам H 2 O на дно тарелки, и тщательно удалить все оставшиеся H 2 O с P200 пипеткой , пока пластинка полностью не высохнет. Параллельно с этим, тепло SDS-PAGE буфера образца, содержащего 100 мМ дитиотреитола (DTT) до 95 ° С в течение 2 мин с использованием тепла блока, а затем добавить его к плите. 200 мкл образца буфера на 100 мм пластины подходит для образцов должны быть рассмотрены с помощью иммуноблот. Для анализа ЕСМ методом масс-спектрометрии, достичь более концентрированного образца путем сбора буфера для образцов SDS-PAGE с блюда (как описано в пунктах 4.5 и 4.6, ниже), повторно нагрева до 95 ° С, и с помощью того же аликвоты по 2-3 дополнительные пластины. С помощью мобильного скребок, чтобы тщательно очистить ECM от тарелки, гарантируя, что все районы блюда были соскабливают. С помощью клеточного скребка, собирать пробы на одной стороне тарелки и удалить его с 200мкл наконечник пипетки в трубку. Передача любого остаточного SDS-PAGE образца буфера экстракта из наконечника клеточным скребком в трубку, чтобы свести к минимуму потери материала ЕСМ. Для получения концентрированного образца, повторно нагревать ту же SDS-PAGE образца буфера аликвоты до 95 ° С и повторно использовать его через 2-3 дополнительных пластин. Устраните белков ЕСМ с помощью ДСН-ПААГ 12, используя или 7% или 4-7% градиентном полиакриламидном геле. ПРИМЕЧАНИЕ: Это удобно использовать предварительно окрашенные белковые маркеры. Для повышения разрешающей способности ECM белков с высокой молекулярной массой, продлить время гель бега таким образом, что 37 кДа маркер молекулярного веса проходит близко к нижней части геля и маркеры молекулярного веса <37 кДа убежал гель. Для протеомики анализа белков ЕСМ, окрашивает гель с белком пятно и захватить изображение. Вырезать полосы, представляющие интерес из геля, переваривают их с помощью трипсина, и анализировать их с помощью матричной лазерной десорбцией / ионизацией (MALDI) спектрометрия массовая <SUP> 13. В качестве альтернативы, для более всестороннего анализа экстракта ECM и проанализировать весь образец, ломтик геля полосу на секции, переваривают их с помощью трипсина, а также выполнять жидкостной хроматографии-масс – спектрометрии (LC-MS) 14. В качестве альтернативы, для иммуноблоттинга 15, передача белков из геля SDS-PAGE на поливинилиденфторид (PVDF) мембрану при 15 В в течение не менее 1 ч 10 мин (полусухой метод) , чтобы обеспечить передачу белков ЕСМ с высокой молекулярной массой , Визуализируйте общего белка передается на мембрану с пятном Ponceau S. После этапа 4.11, используют антитела для определения присутствия и / или сделать полуколичественный анализ отдельных белков ЕСМ 15. Блок мембраны с 2% (вес / объем) молока в TBS-Tween 20 (блокирующий буфер) в течение ночи при 4 ° С. Развести специфических антител к белкам ЕСМ в блокирующем буфере и инкубировать с мембраной в течение 1,5 ч при комнатной температуре (антитела к привратьronectin разводили 1/600 и антитела к тромбоспондин-1 разбавленного 1/150; Дополнительная таблица 1). Проверить качество изоляции ЕСМ путем повторного зондирования тот же блоттинг с использованием антител к обильному внутриклеточными белками, такими как актин или тубулин (анти-актин разбавляют 1/10000 и анти-тубулина разводили 1/5000).

Representative Results

Протокол, описанный в шагах 1.1-1.5 акты для удаления клеток и оставить позади клеток, полученных ECM. Протокол был проведен на COS-7 клеток, культивированных в течение 96 ч на покровных стеклах, и клетка-ЕСМ производным анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Обработку гидроксид аммония удаляют клетки эффективно, как это установлено потерей клеточных ядер и цитоскелета, в соответствии с DAPI и фаллоидином окрашивания, соответственно (рис 1). Выделение клеток с 2 М мочевины, не был столь же эффективен, как гидроксид аммония; следы DAPI и фаллоидином окрашивания были обнаружены после лечения. 8 М мочевины имела такой же эффект гидроксида аммония (рисунок 1). Далее, полученной из культур клеток ЕСМ визуализировали до и после обработки гидроксидом аммония (шаги 2.1-2.11). COS-7 клетки трансфицировали мономерного красного флуоресцентного белка (MRFP) -tagged Тромбоспондин-1 С-концевой тримеров (mRFPovTSP1C) 11 и выращивали на 35 мм блюдо с насечкой стеклянной основе. Через два часа после металлизации, подходящий квадрат сетки, которые содержали несколько здоровых клеток, выражающих mRFPovTSP1C визуализировали под конфокальной микроскопии. Контрастное изображение опорной фазы была взята из этой области, а затем флуоресценции покадровой визуализации проводили каждые 1 мин в течение 2 ч (рис 2А). Затем клетки удаляли с помощью гидроксида аммония, и на той же площади сетки на блюдо было перемещено в условиях фазового контраста, а затем повторно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки больше не присутствует в квадрате сетки, но mRFPovTSP1C оставались в пределах ECM, обнаруженных с помощью флуоресцентной микроскопии , как характеристика Puncta (рис 2А). Любое mRFPovTSP1C хранение в ECM до удаления клеток был идентифицирован путем сравнения флуоресценции шаблона периодов до и после удаления клеток. Флуоресцентные Puncta определены в обоих изображениях (FIGUповторно 2А, пример со стрелками) выводятся быть связаны с ЕСМ. обработка гидроксида аммония затем использовали для выделения нативный ЕСМ из культивированных, прилипшие клетки. Человеческие фибробласты кожи (HDF) выращивали на покровных стеклах в течение 96 ч. Клетки были удалены с использованием гидроксида аммония, и ЕСМ зондируют анти-коллаген I антитела, которые демонстрировали характерную фибриллярный и сетчатая окрашивания рисунок 16 (Фигура 2В). Фибронектин структурирование исследовали вокруг фиксированных, непермеабилизированных крысы Хондросаркома клетки (RCS) и в ECM после удаления клеток RCS (рис 2С). Выделение гидроксида аммония ЕСМ также проводят в стерильных условиях, так что "тест" клетки могут быть повторно высевают на ECM для фенотипического или функциональных исследований. Например, "тест" COS-7 клетки засевали в течение 2 ч на стерильном ЕСМ, создаваемом клетками RCS, а ТКурица они фиксировали, проницаемыми, и анализировали на F-актин организации по FITC-фаллоидином окрашивания, по сравнению с COS-7 клеток , продуцирующих свои собственные ECM (шаги 3.1-3.9) (рисунок 3). В более крупном масштабе, метод был использован для выделения ECM для биохимических процедур. Например, RCS клетки выращивали на двух блюдах клеточной культуры 100 мм в течение 7 дней, а процедуры на этапах 4.1-4.7 были соблюдены. Белки в полученной из культур клеток ECM собирали путем соскабливания их в горячем SDS-PAGE образца буфера и разделяли с помощью SDS-PAGE на полиакриламидном геле, 7% при восстанавливающих условиях. Гель окрашивали на белок, и четыре основные полосы были каждый выделяли и анализировали с помощью масс – спектрометрии (фиг.4А). Был выявлен ряд белков ЕСМ, включая фибронектин, Тромбоспондин 1 (TSP1), Тромбоспондин 5 / хрящевой олигомерный матричный белок (TSP5 / сост) и matrilin-1 (рис 4В). В качестве альтернативы, меньшего масштаба препараты ECM могут быть оценены с помощью иммуноблоттинга. Например, клетка-ЕСМ производным от COS-7 клеток , экспрессирующих эктопически mRFPovTSP1C разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на PVDF – мембрану и зондировали RFP с анти-RFP антителом (фиг.4С). Этот метод является достаточно чувствительным , чтобы обнаружить различия в осаждении между нативной тримера TSP1 (mRFPovTSP1C) и сконструированным пентамера из TSP1 С-концевой области (MRFP-ПБО-5-1C) 17 (фиг.4С). Для исследования эндогенного ЕСМ из ДСП высокой плотности, наличие специфических белков в клеточных лизатов или изолированной ЕСМ был осмотрен иммуноблоттинга. Характеристика белков ЕСМ фибронектин и тромбоспондин-1 были обнаружены в ECM, в то время как обильные внутриклеточными белками α-тубулина и β-актина отсутствовали в изолированной ECM (Рисунок 4D). <p class="jove_content" fo:keер-together.within-страница = "1"> Рисунок 1: Сравнение методов клеточной удаления. COS-7 клетки культивировали при высокой плотности в течение 96 ч на покровных стеклах, фиксировали в 2% PFA, и проницаемыми в 0,5% Triton X100, или были обработаны, как указано для удаления клеток. Покровные были затем окрашивали FITC-фаллоидином визуализировать F-актин и DAPI для визуализации ядер. Шкала бар = 25 мкм. Эта цифра изменяется от оригинальной публикации в журнале Cell Science 11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: Идентификация белков ЕСМ в изолированных ECM. (A) фазового контраста и флуоресцентные изображенияCOS-7 клеток, экспрессирующих mRFPovTSP1C и выращены на 35 мм блюдо со стеклянным дном, с насечкой основания в течение 2 ч. Изображения показаны до и после удаления клеток с помощью гидроксида аммония. Край письма сетки указывается в фазоконтрастных изображения с пунктирной линией. Белые стрелки показывают примеры флуоресцентного Puncta, которые присутствовали до и после удаления клеток. (B) Обнаружение коллагена I в HDF ЕСМ непрямой иммунофлуоресценции. HDF выращивали в течение 96 ч и удаляют с помощью гидроксида аммония, и ЕСМ окрашивали для человеческого фибриллярный коллаген I. ЕСМ также окрашивали FITC-конъюгированным антителом против кроличьего вторичным антителом в одиночку. (C) Локализация фибронектина вокруг клеток RCS или в изолированной RCS ECM, который выявляется непрямой иммунофлуоресценции. RCS клетки выращивали в течение 48 ч, фиксировали в 2% PFA, и окрашивают для фибронектина и с DAPI. В параллельных чашек, клетки удаляли с использованием 20 мМ гидроксида аммония и ЕСМ окрашивали для ФиБрonectin и DAPI. Клетки также окрашивают только FITC-конъюгированные антитела против мышиного IgG антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Использование стерильного ECM для функциональных исследований. RCS "производитель Матрикс" клетки выращивали в течение 48 ч на покровных стеклах, а затем обрабатывают 20 мМ гидроксида аммония в стерильных условиях, чтобы удалить клетки. COS-7 "Испытание" клетки высевали на покровные с или без изолированной RCS ECM в течение 2 ч, фиксировали в 2% PFA, проницаемыми в 0,5% Triton X100, и окрашивали FITC-фаллоидином визуализировать F-актина и DAPI для визуализации ядер , COS-7 клетки высевают на RCS ECM распространяться более широко и образуются крупные микрофиламентных пучки (например, со стрелками) и край ершале. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: Идентификация белков из выделенных ЕСМ с помощью SDS-PAGE, масс – спектрометрии или иммуноблоттинга. (А) Клетки RCS выращивали в течение 7 дней , и удалить с помощью 20 мМ гидроксида аммония; ЕСМ был наскреб в горячий SDS-PAGE образца буфера, содержащего 100 мМ DTT. Препарат ЕСМ разделяли с помощью SDS-PAGE на полиакриламидном геле, 7% при восстанавливающих условиях. Четыре полосы (значительные стрелкам 1-4) были идентифицированы с помощью окрашивания белков. (Б) Белки из RCS ЕСМ полос 1-4 были идентифицированы с помощью масс – спектрометрии MALDI. (C) , COS-7 клетки , экспрессирующие либо mRFPovTSP1C (тример) или MRFP-ПБО-5-1C (пентамера) культивировали в течение 48ч и удаляют с помощью 20 мМ гидроксида аммония, и был выделен ЕСМ в горячий SDS-PAGE образца буфера, содержащего 100 мМ ДТТ. Препарат ЕСМ разделяли с помощью SDS-PAGE на полиакриламидном геле, 7% в восстановительных условиях, переносить на PVDF мембрану и зондируют анти-RFP антителом. Эта панель изменяется от оригинальной публикации в Bioscience Reports 17. (D) HDF выращивали в течение 96 ч , а затем обрабатывают либо с помощью 2% дезоксихолевой кислоты в PBS (клеточного лизата) или с 20 мМ гидроксида аммония для удаления клеток. ЕСМ выскребали в горячем SDS-PAGE образца буфера. Две фракции разделяли с помощью SDS-PAGE на полиакриламидном геле в 10% в восстановительных условиях, переносить на PVDF мембрану и зондируют с использованием антител, как указано. В каждой панели, позиции маркеров молекулярной массы указаны в кДа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого фифигура.

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола

Метод имеет некоторые важные шаги, которые необходимо соблюдать для обеспечения успешного выделения и анализа ECM. Например, гидроксид аммония используется для удаления клеток и изолировать ECM для анализа. Несмотря на то, гидроксид аммония стабилен в водных растворах, в темноте, и можно хранить при комнатной температуре, бутылки должны быть плотно повторно запечатать между каждым использованием. Поскольку газ может испаряться из раствора, тем самым снижая концентрацию, мы настоятельно рекомендуем начать новую бутылку каждые 6-8 недель. Кроме того, рабочий раствор должен быть свеже для каждого эксперимента. Важно также, что клетки полностью удалены с обильными промываний в деионизированной воде. Если эти шаги не будут выполнены надлежащим образом, клеточный материал может оставаться на блюдо и загрязнять вниз по течению анализов. Если клетки были выращены в течение 10 дней или дольше, могут потребоваться дополнительные промывки водой. Важно, чтобы пОТЕ , что изолированный ЕСМ слой обычно очень тонкий по сравнению с клетками ^11, так что необходима осторожность при определении ECM во время формирования изображения. Для эффективного извлечения выделенного внеклеточного матрикса в буфер SDS-PAGE образца, необходимо, чтобы буфер выборки содержит восстанавливающий агент. Для наиболее эффективного удаления ECM, необходимо использовать кипящую докрасна буфера образца. Для экспериментов, в которых образцы ECM будут решены с помощью SDS-PAGE электрофорезе окрашиванию белка или протеомики, это имеет решающее значение для достижения сконцентрированной пробы путем соскоба несколько пластин достоинства ЕСМ в то же аликвоты буфера для образцов.

Модификации и устранение неисправностей

Производство и секреции белков ЕСМ могут значительно различаться между типами клеток, поэтому периоды времени для секреции и отложение ECM должно быть определено заново для каждого типа клеток. Важно также иметь в виду, что ECM состав будет динамически изменяться в отношении то плотности клеток и времени в культуре ^18. Этот фактор следует принимать во внимание при проектировании экспериментов. Очевидно, что выбор типа клеток для этого метода является важным, в частности, при извлечении ЕСМ для анализа методом масс-спектрометрии, что может потребовать значительного количества общего белка ЕСМ.

Ограничения техники

Клетки, которые секретируют очень низкие уровни белков ЕСМ будет более сложным для использования с этим методом. Не прилипших клеток, культуры клеток, 3D или инвазии клеток анализы непригодны в настоящее время для изоляции ECM этим методом. Метод является наиболее подходящим для использования со стандартными "2-мерных" клеточных культур. Поскольку экстракция гидроксид аммония удаляет клетки полностью, ECM, связанные с верхними сторонами клеток и секретируется, но не сшитый, белков ЕСМ, также удаляются, оставляя на тарелку тонкий слой собранного ЕСМ снизу и вокруг базы клеток ^11,17 </SUP>. Сложно количественно оценить, насколько ЕСМ высвобождается при экстракции гидроксида аммония, так как выпущенный материал также включает в себя ECM белки, которые являются внутриклеточными или до секреции или после того, как поглощение происходит через поверхность клетки.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Способность проводить широкий спектр экспериментов с изолированным ECM имеет важное значение в контексте клеточной биологии и физиологии тканей, а также имеет последствия для области регенерации тканей и тканевой инженерии. Способ имеет преимущества по сравнению с гелями, образованных из очищенных коллагены или других очищенного белков ЕСМ в том, что клетки собрать комплекс ECM структур на их родной размер, с носителями механизмов сшивающих и с отдельными ECM белков, присутствующих в соотношениях, соответствующих типу клеток происхождения. Например, протеомики исследование RCS ECM продемонстрировал обильные matrilins и COMP / TSP5, как и ожидалосьхрящевой ECM ^19,20 (Рисунок 4). В общем, анализ полученной из культур клеток ECM затрудняется по своей природе, как обширную, мульти-белковой сети, что приводит к сшиванию ковалентной и нерастворимости многих белков ЕСМ, а также от возможного загрязнения ЕСМ экстрактов с внутриклеточными белками. Процедура многоэтапным предназначена для изолирования ECM фракции из тканей для протеомики анализа дали 8% белков ЕСМ в общем наборе белков , идентифицированных ^21. Тем не менее, пептиды из белков ЕСМ были 73% от общего количества пептидов, идентифицированных. Этот метод для выделения и анализа клеток, полученных ECM быстро и надежно удаляет клеточный материал, сохраняя при этом белкам ЕСМ. Этот метод может быть использован для различных типов клеток и последующих применений и облегчает анализ ЕСМ биологии и клеточно-ECM взаимодействий в клеточной культуре. Наши протоколы подробно, как этот метод может быть применен в различных масштабах для решения широкого спектра ехрerimental вопросы, касающиеся организации ECM, динамики, или композиции, а также функциональных эффектов изолированного ECM на клетках.

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

Глядя в будущее, метод может быть адаптирован для использования с культурами клеток 3D; это расширит свое физиологическое значение. Decellularized родной ткани имеет большой потенциал в качестве каркаса для регенерации утраченных или поврежденных тканей и в качестве альтернативы трансплантации, например, после сердечной недостаточности ^22. У него есть потенциал, чтобы преодолеть проблемы доступности доноров и immunorejection. Будущие применения метода, описанного в настоящем докладе, можно исследовать его использование с клеточными культурами 3D или decellularization ткани, что приведет к дальнейшему увеличению объема данного подхода.

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot