Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen
Summary
Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.
Abstract
Die effizienteste Transduktion bestimmter Gene in natürlichen killer (NK)-Zellen ist eine große Herausforderung gewesen. Erfolgreiche Transductions sind entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Gens von Interesse in der Entwicklung, Differenzierung und Funktion von NK-Zellen. Die jüngsten Fortschritte im Zusammenhang mit Chimären Antigen-Rezeptoren (Autos) im Krebsimmuntherapie betonen die Notwendigkeit für eine effiziente Methode zu exogenen Gene Effektor Lymphozyten liefern. Die Wirkungsgrade von Lentivirale vermittelte gen Transductions in primären Mensch oder Maus-NK-Zellen bleiben deutlich niedriger, was ein wichtiger begrenzender Faktor. Die jüngsten Fortschritte mit kationischen polymeren, z. B. Polybrene, zeigen eine verbesserte gen Transduktion Effizienz in T-Zellen. Doch scheiterte dieser Produkte, die Transduktion Wirkungsgrade von NK-Zellen zu verbessern. Diese Arbeit zeigt, dass Dextran, verzweigte Glucan Polysaccharid, verbessert erheblich die Transduktion Effizienz von Mensch und Maus primären NK-Zellen. Dieser hoch reproduzierbare Transduktion Methodik bietet ein kompetenter Werkzeug für transducing menschliche primäre NK-Zellen, die klinischen gen Lieferung Anwendungen und somit NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie. erheblich verbessern können
Introduction
Natürliche killer (NK)-Zellen sind die großen lymphatischer Bevölkerung des angeborenen Immunsystems1. NK-Zellen fungieren als Erstlinien Verteidiger der Host Immunantwort gegen Tumoren und Infektionen2,3,4. NK-Zellen spielen auch eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der Toleranz durch die Sekretion von potenten Zytokine und Chemokine5. Aufgrund ihrer starken Fähigkeit, gezielt zu beseitigen Tumorzellen werden mehrere klinische Studien durchgeführt, um Spender-abgeleitete menschliche NK-Zellen als eine Adoptive Immuntherapie bei Krebs6,7zu bewerten. Im Gegensatz zu T-Zellen muss der Entwicklungsbiologie von NK-Zellen noch gut charakterisierten8. Diese Unkenntnis ist teilweise wegen fehlender effizienter Techniken, die Gene von Interesse an Maus oder menschliche primäre NK-Zellen zu liefern. Aus diesen Gründen haben die meisten NK-Zell in Zell-Linien, anstatt in Primärzellen Studien. Daher ist die Notwendigkeit für ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zum primären NK-Zellen mit Genen von Interesse transduzieren entscheidend.
Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine konsistente und zuverlässige Methode zu formulieren, mit der primären menschlichen oder murine NK-Zellen mit Lenti oder Retroviren ausgestrahlt werden könnte.
Frühere Studien, die versuchten, dieses Problem zu beheben wurden durchgeführt, weitgehend über die vorübergehende Umwandlung von primären NK-Zellen. Dazu gehören Plasmid Transfektion9,10, Epstein – Barr-Virus (EBV) / retrovirale Hybrid Vektor11, “Vaccinia” Vektoren12,13und Ad5/F35 Chimären adenovirale Vektoren14. Trotz der bescheidenen Wirkungsgrad dieser Techniken macht die vergängliche Natur der Transduktion sie ungeeignet für die langfristige Nutzung von gentechnisch veränderten NK-Zellen. Einige neuere Studien haben retrovirale Vektoren verwendet, um transduzieren NK-Zellen, erfordern mehrere Zyklen der Infektion auf ein akzeptables Niveau der gen-Expression-11,–15zu erreichen. Im Gegensatz zur retroviralen Vektoren können Lentivirale Vektoren Wirtszelle nuclear Import Maschinen die virale Vorintegration Komplex translozieren in den Zellkern. Dies ist ein großer limitierender Faktor bei der Replikation des Virus in nicht-teilenden Zellen, die primäre NK-Zellen enthalten.
Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Rezeptoren der Zelloberfläche und virale Partikel erlauben virale Aufnahme in die Zelle. Die ersten Kämpfe zwischen der Virushülle Proteine und ihre Verwandten Host-Rezeptoren könnte wegen der potenziellen negativen Ladungen zwischen diesen beiden bestehenden beschränkt werden. Das Grundprinzip hinter vielen Transduktion Techniken ist, dass die Zugabe von kationischen polymeren, z. B. Polybrene (Pb), Protamin Sulfat (PS) oder Dextran, könnte eine positive Ladung an die Rezeptoren der Zelloberfläche und damit die Bindung der Virushülle ergänzen Proteine. Dies erhöht die Fusion-Effizienz und die Aufnahme der viralen Partikel von den Zellen16. Obwohl es berichtet wurde, dass Pb oder PS Gentransfer in T Zellen17verbessern kann, ihre Anwendung nicht in die Transduktion Effizienz der primären NK-Zellen auswirken. Darüber hinaus wurde eine vergleichende Analyse zwischen dieser Reagenzien mit primären NK-Zellen nicht durchgeführt. In dieser Studie wurden die Transduktion Wirkungsgrade der drei kationische Polymere verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter diesen drei kationischen polymeren nur Dextran effiziente virale Transduktion in Maus und menschliche primäre NK-Zellen deutlich erhöht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie zeigt, dass die Verwendung von Dextran als ein kationisches Polymer-Agent die Lentivirale Transduktion Effizienz der murinen und menschliche primäre NK-Zellen verbessert. Darüber hinaus haben andere kationische Mittel, wie Pb oder PS, keinen erkennbaren Einfluss auf die Lieferung von viralen Vektoren in menschliche primäre NK-Zellen. Zuvor wurde nachgewiesen, dass Pb gen Transduktion in menschlichen T-Zellen-17ergänzen kann. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass weder Pb noch PS ei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Lucia Sammarco und ihr Lulus Lemonade Stand für Inspiration, Motivation und Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH R01 AI102893 und NCI R01 CA179363 (S.M) unterstützt; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI-1R01CA164225 (L.W); der Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Das HRHM-Programm des MACC Fonds (S.M.; S.R.; M.S.T); die Nikolaus-Familienstiftung (S.M.); Gardetto Familie (S.M.); die Hyundai-Gelehrten Programm (M.S.T.); Hyundai Hoffnung auf Rädern (S.R.); die MACC-Fonds (M.S.T. und S.M.); die Kinder-Forschungsinstitut, MCW (S.R.); und Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
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