This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.
In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.
Målet med denna metod är att skapa en reproducerbar modell för svår, flöde-inducerad pulmonell arteriell hypertension i råttor och att mäta dess princip hemodynamiska och histopatologiska ändpunkter.
Pulmonell arteriell hypertension (PAH) är en kliniskt syndrom som omfattar en progressiv ökning av pulmonell vaskulär resistens som leder till höger kammare misslyckande och död. Inom ordnade sjukdomsspektrat av lunghypertonisjukdomar (PH), är PAH den allvarligaste formen och en som återstår utan ett botemedel en. Den underliggande arteriopati i PAH kännetecknas av en typisk form av vaskulär remodellering som ockluderar kärllumen. Muscularization av normala icke-muscularized fartyg och hypertrofi av mediala fartyget skiktet betraktas som fenomen tidiga sjukdoms i PAH, ses också i andra former av PH 2, och tros vara reversibel 3. Som PAH advances börjar intimala skiktet att renovera, så småningom bildar karakteristiska neointimala skador 2. Neointimal-typ pulmonell vaskulär ombyggnad är exklusiv för PAH och är för närvarande anses vara oåterkallelig 4.
Som PAH är en ovanlig sjukdom, avancerar i sin pathobiological förståelse och utveckling av nya terapier har förlitat sig tungt på djurmodeller. Den monocrotalin (MCT) modell i råttor är en enkel enda träff modell som har varit, och är fortfarande, används ofta. MCT är ett gift som orsakar skador på lung arteriolerna och regional inflammation 5. 60 mg / kg MCT leder till en ökning av det genomsnittliga pulmonella artärtrycket (mPAP), pulmonell vaskulär resistans (PVR) och höger kammare hypertrofi (RVH) efter 3 – 4 veckor 6. Den histomorphology kännetecknas av isolerade medial hypertrofi utan neointimala skador 5. MCTråttmodell representerar sålunda en moderat form av PH, och inte PAH, även om det är allmänt presenteras som den senare.
Hos barn med PAH associerad med en medfödd vänster till höger shunt (PAH-CHD), ökad pulmonell blodflödet betraktas som väsentliga trigger för utvecklingen av neointimala skador 7, 8, 9. Hos råttor, kan ökad pulmonell blodflöde induceras genom skapandet av en shunt mellan bukaorta och vena cava, en teknik som först beskrevs 1990 10. Alternativ för att skapa ökad lungflöde är genom ett ensidigt Pneumonectomy eller subclavia till lungartären anastomos 11. Konceptuella nackdelar med dessa modeller består av potentiell kompensatorisk tillväxt av den återstående lungan och adaptiv väg aktivering induceras av Pneumonectomy, eller iatrogen skada lungkärlen på grundtill lungartären anastomos, både förbryllande effekterna av ökad pulmonell blodflödet.
När ett aorto-caval shunt skapas och en ökning av pulmonala blodflödet induceras som en andra hit i MCT-behandlade råttor, karakteristiska neointimala lesioner uppträder, och en svår form av PAH och tillhörande höger kammarsvikt (RVF) utveckla 3 veckor efter den ökade flöde 12. Den hemodynamiska utvecklingen av PAH i denna modell kan bedömas in vivo genom ekokardiografi och högersidig kateterisering. Den vaskulära histomorphology, kärlets väggtjocklek, graden av arteriolar ocklusion, och parametrar för höger kammare inte är grundpelarna i ex vivo karakterisering av PAH.
Denna metod beskriver detaljerade protokoll för aorta-cava shunt (AC-shunt) kirurgi, rätt hjärtkateterisering och kvalitativ och kvantitativ bedömning av vaskulär histomorphology.
Denna metod beskriver det kirurgiska ingreppet av en aorta-cava shunt hos råttor som förbehandlats med MCT för att skapa flödes inducerad PAH och tekniker för att bedöma princip hemodynamiska och histopatologiska slutpunkter som kännetecknar PAH och denna modell.
Kritiska steg i protokollet och felsökning
Kirurgi och post-kirurgi. Under aorto-caval shunt kirurgi, är det mest kritiska steget dissektionen av aorta och vena cava. Membranen som omger aortan och…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, the Dutch Heart Foundation, the Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development, and the Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Shunt Surgery |
|||
Sterile surgical gloves | |||
Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
Chloride-Hexidine | |||
Cotton swabs | |||
Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
Sodium Chloride 0.9 % | |||
Ventilation mask Rat | |||
Scalple blade | |||
Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
Heat mat | |||
Kocher Clamp | |||
Shaving machine | |||
Microscope | Leica | ||
Right Heart Catheterization |
|||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sterile surgical gloves | |||
Eye ointment | Duratears | ||
Chloride-Hexidine | |||
Cotton swabs | |||
Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
Pressure transducer | Ailtech | ||
Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
Shaving machine | |||
10mL Syringe | |||
Sodium Chloride 0.9 % | for flushing | ||
Vascular Morphology |
|||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50ml Syringe | |||
4 % Formaldehyde | |||
18 G cannula with tube | |||
Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
Image-J | |||
Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html |
http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |