Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein reproduzierbares Modell für schwere, strömungsinduzierten pulmonaler arterieller Hypertonie in Ratten zu erzeugen und ihr Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu messen.
Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist ein klinisches Syndrom, das eine progressive Zunahme des pulmonalen Gefässwiderstands führt zu Rechtsherzversagen und Tod umfasst. Innerhalb des übergeordneten Krankheitsspektrum der Lungenbluthochdruckerkrankungen (PH) ist PAH die schwerste Form und eine , die 1 ohne Heilung bleibt. Die zugrunde liegende Arteriopathie in PAH wird durch eine typische Form der Gefäßumbau gekennzeichnet, dass das Gefäßlumen verschliesst. Muskularisierung von normalen , nicht muskularisierte Gefäße und Hypertrophie des medialen Gefäßschicht als frühe Krankheitserscheinungen bei PAH angesehen werden, werden auch in anderen Formen der PH 2 und sind gedacht , gesehen 3 reversibel. Als PAH eindvances beginnt die Intima - Schicht umzubauen, schließlich charakteristische neointimalen Läsionen bilden 2. Neointima-Typ pulmonalen Gefäßumbau ist exklusiv für PAH und wird derzeit unumkehrbar 4 zu betrachten.
Als PAH eine seltene Krankheit ist, geht in seiner pathobiologischen Verständnis und Entwicklung von neuartigen Therapien haben sich stark auf Tiermodelle verlassen. Die monocrotalin (MCT) Modell bei Ratten ist ein einfaches Single - Hit - Modell , das war und ist immer noch, häufig verwendet. MCT ist ein Toxin , die eine Schädigung der Lungen Arteriolen und regionalen Entzündung 5 verursacht. 60 mg / kg MCT führt zu einer Erhöhung des mittleren Lungenarteriendruck (mPAP), pulmonaler vaskulärer Widerstand (PVR) und rechte ventrikuläre Hypertrophie (RVH) nach 3 - 4 Wochen 6. Die Histomorphologie wird durch isolierte mediale Hypertrophie ohne neointimalen Läsionen 5 gekennzeichnet. Der MCTso Rattenmodell stellt eine moderate Form von PH, und nicht die PAH, obwohl es allgemein als das letztere präsentiert wird.
Bei Kindern mit PAH in Verbindung mit angeborenem Links-Rechts - Shunt (PAH-CHD), erhöhte Lungenblutung als wesentliche Auslöser für die Entwicklung der neointimalen Läsionen 7, 8, 9 betrachtet wird. Bei Ratten erhöhte Lungenblutfluss kann durch die Schaffung eines Shunt zwischen der abdominalen Aorta und Vena cava, eine Technik erstmals 1990 beschrieben , 10 induziert werden. Alternativen erhöht zu schaffen Lungenfluss sind durch einseitige pneumonectomy oder durch subclavian zu Lungenarterie Anastomose 11. Conceptual Nachteile dieser Modelle bestehen aus Potentialausgleichs Wachstum der verbleibenden Lunge und adaptive Signalweg-Aktivierung durch die pneumonectomy induziert oder der iatrogenen Schädigung des Lungengefäßsystems durchzu Lungenarterie Anastomose, verwirrende sowohl die Auswirkungen der erhöhten Lungenblutung.
Wenn ein aorto-Kava-Shunt erzeugt und Lungenblutung erhöht wird als ein zweiter Treffer in MCT-behandelten Ratten induziert, treten charakteristische neointimalen Läsionen und eine schwere Form der PAH und Rechtsherzversagen assoziiert (RVF) entwickeln 3 Wochen nach der erhöhten 12 strömen. Die hämodynamische Progression von PAH in diesem Modell kann in vivo durch Echokardiographie und Rechtsherzkatheter zu beurteilen. Das vaskuläre Histomorphologie, Gefäßwanddicke, dem Grad der arteriolar Okklusion und Parameter für Rechtsherzversagen bilden die Säulen der ex vivo Charakterisierung von PAH.
Diese Methode beschreibt detaillierte Protokolle für die aorto-Kava-Shunt (AC-Shunt) Chirurgie, Rechtsherzkatheter und qualitative und quantitative Bewertung der vaskulären Histomorphologie.
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Protocol
Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der niederländischen Zentralkomitee für Tierversuche und der Animal Care Committee an der University Medical Center Groningen (NL) genehmigt. Beide Wistar und Lewis-Ratten mit Gewichten zwischen 180 und 300 g wurden verwendet.
1. Gehäuse und Akklimatisierung
- Nach der Ankunft in der zentralen Tieranlage, Hausratten in Gruppen von 5 pro Käfig. Während einer 7-Tage Eingewöhnungszeit daran gewöhnen, die Ratten für die menschliche Behandlung, aber üben keine experimentellen Verfahren.
2. Vorbereitung und Injektion von Sterile Monocrotalin
- 1 ml 60 mg / mL monocrotalin (MCT) -Lösung, 60 mg wiegen von monocrotalin in einem 2-ml-Röhrchen. Hinzufügen 700 & mgr; l 0,9% NaCl. Zugabe von 200 ul 1 M HCl. Wärmen Sie die Lösung in der Röhre unter fließendem warmen Leitungswasser und Wirbel es. Verwenden Sie 6 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,0 zu bringen. Verwenden Sie sterile Technik zur Herstellung von MCT für die Injektion in Nagetieren. Injizieren von 1 ml steriles 60 mg / ml MCT Lösung pro kg subkutan in den Hals (0,3 ml von 60 mg / ml MCT für eine 300 g Ratte). HINWEIS: Wir bevorzugen nicht kleinere Mengen zu verwenden, aufgrund der größeren Wahrscheinlichkeit, dass die injizierten Dosis nicht geeignet sein wird.
3. Aorta-Kava-Shunt-Chirurgie
- Anästhesie.
- Füllen Sie die Induktionskammer mit 5% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min) und legen Sie die Ratte in der Kammer. Überprüfen Sie für eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Wiegen Sie die Ratte.
- Rasur und reinigen Sie den Bauch auf einer Fläche, die etwa 8 cm lang und 3 cm breit ist. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Heizmatte (37 ° C) durch eine sterile Matte bedeckt.
- Legen Sie die Schnauze in einer Beatmungsmaske / Kapuze mit 2 - 3% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min). Schauen Sie sich die Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Bewerben Augensalbe Trockenheit zu verhindern, während der Narkose.
- Shunt SurGery.
- Scrub die Haut mit Chlorid-hexidine zur Desinfektion. Injizieren 0,01 mg / kg Buprenorphin subkutan für die postoperative Analgesie.
- Verwenden Sie sterile Instrumente für die Chirurgie. Einen Einschnitt mit einem # 10 Skalpellklinge in den Bauch auf der Mittellinie ab 1 cm unterhalb der Membran eine sich nach unten bis knapp oberhalb der Genitalien.
- Heben Sie den Darm mit einem Wattestäbchen auf, decken den Darm in einem sterilen, feuchten Gaze (0,9% NaCl), und legen Sie sie auf der linken Seite des Tieres.
- Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Membranen zu trennen, die die Bauchaorta und die untere Hohlvene in die umliegenden Gewebe befestigen.
HINWEIS: sezieren nicht die Membranen zwischen der Aorta und die Hohlvene. - Mit Splitterpinzette, entfernen Sie die perivaskulären Aorten Fett knapp oberhalb der Bifurkation, nur auf der rechten Seite der Aorta und nur an der Stelle, wo die Nadel eingefügt wird.
- Verwenden Sie Wattestäbchen die Aorta und Vena Cava von 2 mm Supe zu trennenrior an der Stelle, wo die Nadel eingeführt werden, um Platz zu schaffen für eine Biemer Klemme.
- In diesem Bereich muss zunächst eine lose Ligatur (5-0 Naht) um die Aorta. Erstellen Spannung auf die Ligatur durch einen Kocher Klammer Platzierung auf, und legen Sie dann die Kocher besser als der Schnitt (1A). Legen Sie die Biemer klemmen nur überlegen die Ligatur (Figur e 1A).
- Mit einem Wattestäbchen, komprimieren die vena cava so distal wie möglich auf die Strömung (1A) zu behindern. Biegung eine Nadel (18 G in diesem Protokoll) in einen Winkel von 45 Grad, mit der Öffnung nach außen zeigen (1A).
- Bei einem Winkel von 90 Grad, legen Sie die Nadel in der Aorta, knapp oberhalb der Bifurkation, mit der Öffnung der Nadel auf der linken Seite (Abbildung 1A). Manipulieren die Spitze der Nadel nach links und legen Sie sie in die Hohlvene.
HINWEIS: Die Nadelspitze sollte jetzt sein visiBLE in der Hohlvene (1B). - Verwenden Sie einen zweiten Wattestäbchen das restliche Blut in die Aorta aus der Einstichstelle zu drücken Thrombose zu verhindern. Trocknen Sie den Bereich um den Shunt mit einer sterilen Gaze, um den Kleber ausreichend haften.
- Ziehen Sie die gesamte Nadel aus der Aorta und sofort einen Tropfen Gewebekleber auf die Einstichstelle in der Aorta Anwendung. Achten Sie darauf, nicht mit dem Wattestäbchen auf das Gewebe zu verkleben. Ausspannen Aorta.
- Überprüfen Sie den Shunt manuell durch Ziehen an und die Ligatur an der Aorta proximal der Shunt-Freigabe. Lockern sollte die Hohlvene distal der Shunt in leuchtend rote Farbe und schaffen Turbulenzen am Shunt Ort.
HINWEIS: Anziehen wird das Blut in die Hohlvene zurück zu dunkel rot. - Platzieren Sie den Darm wieder in das Tier. Schließen Sie die Muskelschicht und die Haut mit resorbierbaren 4-0 Nähten. Belüften das Tier mit 100% O 2 aus der Narkose zu erholen.
HINWEIS: Lassen Sie keine animal unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
- Sham-Chirurgie.
- Führen alle obigen Verfahren, mit Ausnahme der Einführung der Nadel in die Aorta.
- Post-chirurgische Versorgung.
- Legen Sie die Ratte in einem einzigen Käfig und in einem Inkubator bei 37 ° C bis zum nächsten Morgen.
- Etwa 6 Stunden nach der Operation, injizieren 0,01 mg / kg Buprenorphin subkutan für die postoperative Analgesie. Wiederholen Sie den nächsten Morgen, wenn die Ratte Anzeichen von Unwohlsein zeigt.
HINWEIS: Die ersten 3 Tage nach der Operation, Ratten neigen dazu, weniger zu essen und zu trinken (dies ist besonders wichtig, wenn Futter oder Trinkwasser mit Drogen gemischt). Die meisten Ratten zeigen normales Verhalten von 3 Tagen nach der Operation. Wenn nicht, genau überwachen. Gewichtsverlust von 15% in 1 Woche überschreitet wird als abnormal, und solche Ratten sollte durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumen während der Narkose eingeschläfert werden.
HINWEIS: In diesem Protokoll wird das Tier durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens, während sie unter Anästhesie eingeschläfert.
- Sacrifice 1 Tag nach der Operation (MF8) für die frühen zellulären und funktionellen Antworten zu einer erhöhten Lungenblutung (zB Gen Hochregulation oder frühen Transkriptionsfaktoren).
- Sacrifice 1 Woche nach der Operation (MF14) für eine im Frühstadium PAH vaskulären Phänotyp (mediale Hypertrophie ohne neointimalen Läsionen).
- Sacrifice von 2 Wochen nach der Operation (MF21) für eine im fortgeschrittenen Stadium PAH vaskulären Phänotyp (markiert mediale Hypertrophie und neointimale Bildung) mit leichter Höhen in RVP und mPAP.
- Sacrifice 3 Wochen nach der Operation (MF28) für eine im Endstadium PAH vaskuläre Phänotyp (markiert neointimalen Okklusion) und eine starke Erhöhung der RVP und mPAP. Klinische Zeichen einer Rechtsherzinsuffizienz sind in diesem Stadium üblich.
- Opfer nach dem 28. Tag (MF-RVFfür) PAH-assoziierten Rechtsherzinsuffizienz (RVF), klinisch als Dyspnoe definiert, schwere Lethargie und Gewichtsverlust (<10% in 1 Woche). Terminate Ratten, wenn eines dieser Zeichen vorhanden ist. Häufig Ratten diese Symptome zwischen den Tagen 28 und 35 und, wenn unbewacht gelassen entwickeln, sterben spontan während dieses Zeitintervalls.
5. Rechtsherzkatheter
- Anästhesie.
- Füllen Sie die Induktionskammer mit 5% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min) und legen Sie die Ratte in der Box. Überprüfen Sie für eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch einen hinteren Zehe Prise durchführen. Wiegen Sie die Ratte.
- Rasur und reinigen Sie den Hals an der rechten Bauchseite der Ratte und für die Echokardiographie-Protokoll, dem Thorax und Oberbauch.
- Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Heizmatte (37 ° C) und legen Sie die Schnauze in einer Beatmungsmaske / Kapuze mit 2 - 3% Isofluran / 100% O 2 (Fluss: 1 L / min). Die Schnauze sollte in Richtung der Forscher konfrontiert werden.
- Echokardiographie-Protokoll.
- Führen Sie die Echokardiographie nach dem Protokoll von Brittain et al. in JoVE 13.
- Katheterisierung Protokoll.
HINWEIS: Um die 15-cm Silizium Katheter zu führen mit einer Kugel 2 mm von der Spitze Dieses Protokoll verwendet eine starre Kanüle mit einem vorgeformten Spitze 20 Grad gebogen. Eine 20-G - Nadel mit seiner Öffnung leicht gebogen nach innen benutzt wird , um die Kanüle in die rechte Halsvene einzufügen (siehe die Liste der Materialien). Ratten in jeder Phase der Progression der PAH und Steuerung kann in diesem Protokoll verwendet werden.- Desinfizieren Sie den Hals mit Chlorid-hexidine. Machen Sie einen 1,5-cm-Schnitt mit einem # 10 Skalpellklinge in der rechten Bauchseitedes Halses, vom rechten Kragen Knochen auf den Kieferknochen.
- Verbreiten Sie das Gewebe einer Schere. Mit einer Pinzette, ziehen Sie das Gewebe auseinander, bis die Halsvene erscheint. Präparieren der Membranen um die Halsvene Splitterpinzette verwendet wird.
- Setzen Sie die Spannung auf die Halsvene durch eine lose Ligatur platzieren (5-0 Naht) um das Gefäß. Erhöhen Sie die Spannung und Band der Ligatur auf die Beatmungsmaske (2A).
- Stromabwärts der Insertionsstelle legen eine lose Ligatur um das Gefäß zu ziehen , nachdem die Kanüle in situ ist , um Leckage und Druckverlust zu verhindern.
- Verwendung der Handgriffe einer Zange, verbiegen leicht die Spitze einer 20-G-Nadel mit der Öffnung an der Innenseite der Kanüle mit dem Katheter zu führen.
- Führen Sie die Spitze des 20-G-Nadel in die Vene und legen Sie schnell die Kanüle des Katheters im Inneren des Gefäßes enthält. Ziehen Sie die Nadel heraus, und schließen Sie dann die Ligaturdass in Schritt 5.3.4 vorbereitet.
- Führen Sie die Kanüle des Katheters in die Halsvene enthält. Die Spitze der Kanüle ist mit einer 20-Grad-Kurve (siehe Schritt 5.3.5). Manövrieren Sie die Kanüle unter dem Schlüsselbein und vorantreiben ein wenig in den rechten Vorhof (Abbildung 2C) einzugeben.
- Um den rechten Ventrikel eingeben, richten Sie die Spitze der Kanüle nach links, in Richtung des Herzens (2D). Auf dem Nacht Monitor sollte eine RV - Druckkurve erscheinen, passend 2D.
- Wenn der RV Druckkurve konstant ist, notieren Sie sich den systolischen und diastolischen Druck des rechten Ventrikels 1 (sRVP1 / dRVP1).
- Manipulieren der Spitze der Kanüle nach links und nach oben. Schieben Sie den Katheter innerhalb der Kanüle (Abbildung 2E).
- Schieben Sie den Katheter in die Hauptlungenarterie (PA). Kein Widerstand sollte spüren, wenn die Pulmonalklappe vorbei.
HINWEIS: Wenn der Katheter die Hauptlungenarterie gelangt, die diastolic Druck steigen. Auf dem Nacht Monitor sollte eine PA - Druckkurve erscheinen, passend 2E. - Wenn der PA-Druckkurve konstant ist, schreiben die Systole, Diastole nach unten, und die mittlere PA Druck 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
- weiter vorantreiben, den Katheter innerhalb der Kanüle, bis die Kugel an der Spitze des Katheters in einer Lungenarterie eingeklemmt wird. Beachten Sie die Druckkurve auf dem Nacht Monitor Abfall und entsprechen den Keil Druckkurve in 2F.
- Wenn der Keildruckkurve konstant ist, notieren Sie sich den systolischen, diastolischen und Keildruck bedeuten.
- Ziehen Sie den Katheter langsam zurück und anschließend messen und notieren Sie sich die Werte für sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2 und dRVP2, auf dem Nacht Monitor angezeigt.
- Wenn in der RV, leicht die Kanüle und Katheter zurückziehen zu messen die mittlere Druck im rechten Vorhof (RAP). Die Kurve sollte die RAP - Kurve in 2A entsprechen.
NEINTE: In diesem Protokoll werden die Ratten nach der Katheterisierung Protokoll durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens während der Narkose eingeschläfert.
6. Morphologie Beurteilung und Morphometry
HINWEIS: In diesem Protokoll wird das Tier durch die Extraktion des zirkulierenden Blutvolumens, während sie unter Anästhesie eingeschläfert. Ratten in jeder Phase der Progression der PAH und Steuerung kann in diesem Protokoll verwendet werden.
- Nach der Tötung nehmen die Lungen aus durch die Luftröhre etwa 5 mm über die bronchiale Bifurkation Schneiden und die Gefäße, die die Lunge zum Herzen zu verbinden. Setzen Sie die Lungen in kalter Kochsalzlösung. Präparieren Sie die linke Lunge. Schneiden Sie die linke Hauptbronchus an der Bifurkation.
- Füllen eines 50-ml-Spritze mit 4% Paraformaldehyd, ein Rohr mit einer Kanüle an der Spritze befestigen, und hängen die Spritze über einen Meter über dem Arbeitstisch. Setzen Sie die Kanüle in der linken Hauptbronchus zu passiv in die Lunge mit Paraformaldehyd zu füllen.Griff Paraformaldehyd mit Vorsicht zu genießen.
- Inkubieren Sie die linke Lunge in Paraformaldehyd für 48 Stunden.
- Dehydratisieren der linken Lunge von sie nacheinander in 70% Ethanol (1 h), 80% Ethanol (1 h), 90% Ethanol (1 h), 100% Ethanol (3 h), Xylol (2 h) Inkubieren und Paraffin ( 2 h).
- Einbetten der linken Lunge in Paraffin, mit dem Lungenhilus die Kassette zugewandt ist.
- Stain , die in Paraffin eingebettet, 4 um Lungenschnitten unter Verwendung eines Verhoeff oder Elastica-van Gieson - Färbung, als den Anweisungen des Herstellers 29. Stellen Sie sicher , dass die elastischen Schichten sind gut differenziert (wie in Abbildung 3). Scannen Sie die gefärbten Schnitten bei 40-facher Vergrößerung.
- Teilen Sie die Lunge in vier Quadranten. In jedem Quadranten finden 10 Schiffe mit einem äußeren Durchmesser von <50 & mgr; m (intra-acinar) und 10 Schiffe mit einem Außendurchmesser von> 50 & mgr; m (pre-acinar). Machen Sie ein Foto (2 x 40 Bilder pro Lunge). Zoom in zufällig bis zu 20-facher Vergrößerung und zu fotografieren jedes Schiffin diesem Blickfeld Selektionsbias zu minimieren.
- Ausschließen Schiffe, die eine längste / kürzeste Durchmesser-Verhältnis von> 2, eine unvollständige Kreisform, oder einen Zusammenbruch von mehr als einem Viertel der Gefäßwand haben.
Hinweis: Ein Beispiel für ein ausgeschlossen Schiff ist in Abbildung jedes Bild 3b Stellen auf der gleichen Vergrößerung (40X) und eine Skala , Bar. - Öffnen Sie ImageJ und das erste Bild. Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste im Bild der Skala einstellen über "Analyse" und "Set - Skala." Für "bekannte Strecke" , verwenden Sie den Wert auf der Skala bar Fotos hoch . Verwenden Mikrometer (& mgr; m) als die Längeneinheit. Stellen Sie die Skala auf globaler Ebene.
- Mit "freihändig Auswahlen" ziehen Sie eine Linie auf dem inneren Rand des luminalen Bereich (Abbildung 3), und verwenden "messen" (Crtl m) diesen Bereich zu messen. Dann ziehen Sie eine Linie um den äußeren elastic Lamina (Abbildung 3) , um den gesamten Gefäßbereich zu messen.
- Berechne den luminalen und Außendurchmesser (
) unter Verwendung von 
. - Berechnen Wandstärke unter Verwendung von
. - Berechnen Sie die Wand / Lumen-Verhältnis unter Verwendung von
. - Berechnen Sie die Okklusion-Score
. - Ergebnis , das Schiff auf Muskularisierung (nein, teilweise oder total Muskularisierung) (3B).
HINWEIS: Gefäße mit einem Doppel Elastica für mehr als die Hälfte des Umfangs definiert sind als vollkommen muskularisierten. Schiffe, die mit einem doppelten Elastica weniger als die Hälfte des Umfangs definiert sind, wie teilweise muskularisierten. - Ergebnis, das Schiff auf der Anwesenheit eines neointima (ja oder nein) (3C).
HINWEIS: Die Schiffe ohne klar definierte interne elastische Lamina kombiniert mit (oft exzentrisch) Luminal Okklusion als neointimale Läsionen definiert.
) unter Verwendung von 
. 
. 
. 
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, Merkmale von MCT + FLOW in Lewis-Ratten in den folgenden Gruppen: Kontrolle (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5) und MF-RVF ( n = 10). Statistische Analysen wurden unter Verwendung der ANOVA Einweg mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt.
60 mg / kg MCT und erhöhter Lungenblutfluss führen zu einem durchschnittlichen Anstieg des systolischen rechten ventrikulären Drucks (SRVP) (23 ± 6 bis 56 ± 11 mmHg), der systolische Pulmonalarteriendruck (sPAP) (20 ± 4 bis 54,0 ± 10 mmHg ) und Lungenarteriendrucks (mPAP) (16 ± 3 bis 36 ± 4 mmHg) bei 28 Tage (MF28) bedeuten. Sie bleiben gleich hoch bis auf die Bühne , wenn Rechtsherzversagen entwickelt (MF-RVF) (Abbildung 4). Am Anfang der PAH-Stufen (MF8 und MF14), kein Anstieg der SRVP, sPAP und mPAP beobachtet. Der diastolische PAP und rechts einProbedruckerhöhung in den späten Phasen, aber nicht signifikant. Wedge Druck ändern sich nicht signifikant während Progression der Erkrankung.
Die rechte ventrikuläre nach links ventrikulärer und septalen Gewichtsverhältnis steigt signifikant von MF14 zu MF-RVF, was anzeigt, rechtsventrikuläre Hypertrophie. Die Leber des nass-zu-Trockengewichtsverhältnis wird deutlich erhöht bei der MF-RVF Stadium, Leber Ödemen und dekompensierter Rechtsherzinsuffizienz anzeigt.
Muskularisierung inner acinar Schiffe <50 & mgr; m erhöht sich schrittweise während Progression der PAH. Die Schiffe dieser Größe normalerweise keine muskulären Mittelschicht in den Kontrollratten haben. Bei MF14, fast die Hälfte dieser Schiffe (43 ± 17%) verfügt über insgesamt Muskel Medien (wie in 3B). Bei MF28 und MF-RVF, fast jede Arteriole wird muskularisierten (98,7 ± 2,5% bzw. 100 ± 0%). Neointima-Läsionen zuerst auftretenbei MF21, MF28 während und MF-RVF, etwa 65% aller Arteriolen haben eine neointimalen Schicht (wie in 3C). Die arteriolar Wand-zu-Lumen-Verhältnis und Okklusion punktet sowohl steigen deutlich von MF14 bis MF28 (jeweils 10,4 ± 3,9 bis 71,5 ± 30 (con: 7,1 ± 0,2) und 20,0 ± 2,8 bis 54,7 ± 10,6 (con: 12,2 ± 0,3) ). Die hämodynamischen und histomorphologische Eigenschaften der Progression der PAH in MCT + FLOW in Wistar - Ratten sind ähnlich 14.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Aorto-Kava - Shunt - Chirurgie. A) Die Aorta wird gespannt und geklemmt besser als die Einstichstelle. Die Hohlvene ist schlechter als die Einstichstelle komprimiert. Die Nadel, bei 45 ° gebogen und mit der Öffnung nach außen, wird in einem 90 ° -Winkel in die Aorta eingeführt. B) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Rechtsherzkatheter Verfahren und Vertreter Druckkurven. A) Die rechte Halsvene wird mit einer Ligatur gespannt und auf die Beatmungsmaske geklebt. Der Katheter wird in die Jugularvene gegeben. B) Ein Bettseitmonitor einen rechten ventrikulären Druckwelle anzeigt. C) Der Katheter innerhalb der Kanüle in dem rechten Vorhof nach dem Einbringen in die rechte Jugularvene gelegt. Unten: ein typischer Druck im rechten Vorhof Welle. D) Der Katheter innerhalb der Kanüle in dem rechten Ventrikel platziert. Unten: ein typisches rechts ventricular Druckwelle im Endstadium der PAH. E) Der Katheter wird in die Kanüle erweiterte die Hauptlungenarterie zu gelangen. Unten: ein typischer pulmonalen arteriellen Druckwelle. F) wird der Katheter in die Lungenarterien vorgeschoben , bis ein Keildruckwelle auf dem Monitor angezeigt wird. Unten: ein typischer Lungenkeildruckwelle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Vaskuläre Morphologie und Morphometrie in der Kontrolle und PAH Ratten. A) Eine normale, nicht-muskularisierte Behälter mit einem Verschluss - Score von 3,7%. B) Ein völlig muskularisierte arteriole mit einem Verschluss - Score von 24,3%. C). Eine neointimale Läsion mit einem Verschluss-Score von 54,1%. D) E) Die Messung des Gesamtbehälters und luminalen Fläche (in einem Gefäß mit einer schematischen Darstellung einer neointimale Läsion), einschließlich der Berechnungen. Die Balken stellen 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse der pulmonalen Hämodynamik und Gefäß Morphologie / Morphometry. Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung der ANOVA Einweg ausgeführt mit Bonferroni korrigiert. Werte sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. con: Kontrolle; MF (monocrotalin + flow); RVF: Rechtsherzversagen; s: systolischen; d: diastolischen; m: Mittelwert; RVP: rechte ventrikuläre Druck; PAP: PULMONARy arteriellen Druck; RAP: Druck im rechten Vorhof. RV: rechte Ventrikel; LV: linker Ventrikel; IVS: Scheidewand; BW: Körpergewicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Verfahren beschreibt das chirurgische Verfahren eines aorto-Kava-Shunt bei Ratten mit MCT vorbehandelt strömungsinduzierten PAH und die Techniken zu schaffen, das Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu bewerten, die PAH und dieses Modell zu charakterisieren.
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls und Fehlerbehebung
Chirurgie und nach der Operation. Während der aorto-Kava-Shunt-Chirurgie, der wichtigste Schritt ist die Dissektion der Aorta und Vena Cava. Die Membranen, die die Aorta und Vena cava umschließen sollte ausreichend zerlegt werden gut zu schaffen 1) Sichtbarkeit des aortischen Bereich, in dem die Nadel eingeführt wird, und der Position der Nadel in die Vena cava nach dem Einsetzen und 2) ausreichend Platz klemmen die Aorta über der Einstichstelle. Dieselben Membranen sind jedoch auch die Aortenblut Durchführung durch die Einstichstelle zwischen den beiden Gefäßen (1) verwendet wird . Sezieren die zu Membranen viel wirdbewirken, dass der Shunt auslaufen. Gewebekleber kann die Leckage zu lösen, aber es kann dann sickert auch in den Shunt, beeinträchtigen seine Größe. Wenn der Kleber Strom durch den Shunt oder entweder der Gefäße beschränkt ist, kann der Kleber leicht entfernt werden, aber Ruptur der vena cava oder der Membranen, die die Shunt leiten auftreten. Die Größe oder Angemessenheit des Shunts kann durch Vergleich der Farbdifferenz und der Grad der Turbulenz des Blutes in der vena cava während der Kompression und Dekompression der proximalen Aorta mit einem Wattestäbchen geschätzt werden.
Ein 18-G - Nadel wurde eine ausreichende Shunt zu schaffen gezeigt , die in Lewis (dieser Artikel) in einem einheitlichen und reproduzierbaren Form Progression der PAH - Ergebnisse und Wistar (siehe 14 Referenz) Ratten und der rechten ventrikulären Volumenüberlastung 15. Ein 18-G-Nadel geschaffen, um die meisten gut ausgewogene Shunt, mit deutlich Lungenfluss auf der einen Seite und eine geringe postoperative Komplikationsrate auf der anderen Seite erhöht. Die häufigste postoperative Problem ist, Gewichtsverlust. Gewichtsverlust bis zu 10% in 1 Woche tritt in allen Ratten nach der Operation, was vermutlich auf geringere Aufnahme in den ersten Tagen nach der Operation. Die Ratten werden eingeschläfert, wenn der Gewichtsverlust von 15% in 1 Woche überschreitet, da dies ein Zeichen von Unwohlsein betrachtet wird. Flüssiges Futter kann in der ersten Woche nach der Operation verbessern Fütterung. Seltene postoperativen Komplikationen sind Hinterbein Lähmung und Darm-Ischämie, die auch in Euthanasie führen. Insgesamt weniger als 5% der Ratten hatten Operation eingeschläfert werden.
Katheterisierung. Kritische Schritte während der Katheterisierung Protokoll mit der Regulierung der Narkose beginnen. Die Tiefe der Anästhesie sollte so gering wie möglich sein (1,5 bis 2% Isofluran in diesem Protokoll), wie eine Erhöhung der Anästhesietiefe erscheint rechten Ventrikels und Lungenarteriendrucks zu verringern, insbesondere in Ratten, die mit Rechtsherzinsuffizienz. Messungen haben eine Tendenz zu become unzuverlässig, wenn das Protokoll über 20 min Dauer.
Der nächste kritische Schritt ist die Manipulation des Katheters in der RV und in der Hauptlungenarterie. Dies kann eine Herausforderung sein. der Katheterspülung kann der Katheter in der Ausflusstrakt der Kurve helfen, wenn die Spitze in der RV Knochenbälkchen steckt. Die Manipulation selbst kann RV Dyskinesie verursachen, die auf dem Nacht Monitor unregelmäßig Druckkurven zeigt. Die Einführung des Katheters in den rechten Ventrikel und die Lungenarterie sollte reibungslos. Wenn die Spitze an der Pulmonalklappe stecken bleibt, wird ein Widerstand zu spüren. durch diesen Widerstand drücken, kann die Pulmonalklappe zum Bruch führen, was die Zuverlässigkeit der nachfolgenden Messungen begrenzt.
Im vorliegenden Protokoll, Ratten werden nach der Katheterisierung Verfahren geopfert. In der Theorie der Jugularvene und chirurgische Wunde kann jedoch geschlossen werden, nachdem der Katheter herausgezogen wird, als Tiere mit nur lebendie restlichen Halsvene links.
Morphometry. Bei der Beurteilung der Gefäßwanddicke und Okklusion Partituren, der kritischste Schritt ist, die elastischen Lamellen zu identifizieren. Aus der Erfahrung, ist die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs zu diesem Zweck mit einem gut differenzierten Verhoeff oder Elastica-van Gieson-Färbung am größten ist. Während das Lumen in der Regel leicht von der Intima zu erkennen ist (interne vaskulären Bereich zu messen), Unterscheidung der Medien von der Adventitia kann einen genaueren Blick erfordern (die äußere Gefäßbereich zu messen). Einige Protokolle Maß intimale und mediale Dicke getrennt, die Definition der Intima als Schicht zwischen dem Lumen und den internen elastischen Lamina und Medien als Schicht zwischen der inneren und äußeren elastischen Lamina. Dies ist in der Regel möglich, in MCT Frühstadium + FLOW PAH. Allerdings Arteriolen in fortgeschrittener Erkrankung, insbesondere neointimalen Läsionen können mehrere elastische Schichten angezeigt werden und verlieren oft die Integrität der elastischen Schichten ( Vorteile und Grenzen der Zugabe des Fluss als Auslöser Die Verwendung von erhöhten pulmonalen Blutfluss PAH zu schaffen, in Ratten hat mehrere Vorteile, die prominenteste ist, dass es eine bekannte (patho-) physiologischen Auslöser für die Krankheit ist, die Übersetzung für die menschliche PAH-CHD (Eisenmenger- Physiologie) begünstigt, sondern auch auf andere Formen von PAH 9. Das Modell erlaubt die Regulierung der Strömung durch die Größe der Nadel variierende wenn die AC-Shunt zu schaffen. in huMann PAH-CHD, Schließung des Shunt wird in der Frühphase der Erkrankung auf die Auflösung von PAH führen, aber bis zur Progression von PAH in fortgeschrittenen Krankheitsstadien. Verschluß des Shunts in vivo erlauben würde man die Wirkung der Entfernung des Auslösers zu verschiedenen Zeitpunkten der Krankheitsprogression zu untersuchen und somit die Mechanismen der (Nicht) Umkehrung der PAH zu untersuchen. Leider derzeit Shunt-Verschluss ist im aktuellen Modell nicht durchführbar. Die Auswirkungen der hämodynamischen Normalisierung ( zum Beispiel die Entfernung von überschüssigem Strömung und die Normalisierung der Lungenarteriendruck) in Ratten , die mit Strömungsassoziiertes PAH kann durch Transplantation der betroffenen linken Lunge in eine Empfängerratte mit normaler Durchblutung untersucht werden. Es wurde zuvor gezeigt , dass die hämodynamischen Normalisierung in Ratten durch Lungentransplantation und in menschlichen PAH-CHD der Sender durch Schließen eines Herz Shunt führt zur Regression der Hypertrophie medial in der Frühphase PAH 21. Die Auswirkungen der hämodynamischen normalensierung in den fortgeschrittenen Stadien der experimentellen Strömungs PAH sind derzeit nicht bekannt. Bedeutung bei alternativen Modelle Der Single-Hit MCT-Modell. Eine subkutane Injektion von 60 mg / kg MCT ist eine einfache und effektive Möglichkeit, ein Modell für die pulmonale Hypertonie in Ratten zu erzeugen. MCT induziert pulmonale arterielle endotheliale Zellschädigung, gefolgt von Hypertrophie der Muskelschicht der Pulmonalarterien 5. Obwohl die genauen Mechanismen unklar bleiben, wurden verschiedene Wege und Wachstumsfaktoren identifiziert, die in medialer Hypertrophie folgenden MCT teilnehmen. Pharmazeutische Intervention auf diese Wege oft erfolgreich medial Hypertrophie und mPAP in MCT-Ratten reduziert. Da jedoch mediale Hypertrophie eine natürliche Tendenz haben , ist bekannt , umgekehrt beim Menschen 3 und auch umgekehrt spontan in MCT-Ratten 16, um die Wirkung dieser Behandlungen beschriebenkritisch zu beurteilen. Die Doppel-Hit MCT + FLOW-Modell. Die Zugabe erhöhter Lungenblutfluss 7 Tage nach der Injektion MCT kritisch verändert das (vascular) Phänotyp in einer charakteristischen zeitabhängig. Bei MF14 (7 Tage nach der Induktion der erhöhten Strömungs), die normalerweise nicht muskularisierte Gefäße beginnen einen muskulösen Mittelschicht zu entwickeln. Bei MF21 treten die mediale Dicke zunimmt und die ersten neointimalen Läsionen. Bei MF28 wurde eine neointimalen Schicht in der Mehrzahl der Gefäße entwickelt. Zwischen MF28 und MF35, die meisten Ratten Rechtsherzversagen entwickeln und seiner Folgeerscheinungen sterben. Frühere Studien in MCT + Fluss Ratten haben gezeigt, dass die Zugabe von Strömung zu MCT auf die Aktivierung von spezifischen Cluster von Genen führt. In einigen Clustern Gegensatz Strömung, die durch MCT induzierten Effekte; in anderen, diese Effekte verstärkt fließen und ein Cluster enthalten Gene , die speziell nach Flusshochreguliert waren 17. Einer dieser Strömungsspezifischen Genen ist diefrühe Wachstumsantwort-1 - Gen 14 (Egr-1). Frühe Hemmung der Egr-1 führte zur Dämpfung von PAH und neointimale Bildung in MCT + Flow - Ratten 18. Egr-1 wurde auch mit neointimalen Umbau im menschlichen PAH (PAH-CHD und idiopathische PAH) 19 verbunden. Diese Beobachtungen ergänzen die Beweise dafür, dass Lungenblutung ist ein wesentlicher Auslöser für die neointimale Bildung erhöht oder gestört. Die Single-Hit Flow-only-Modell. Bei Ratten mit einem aorto-Kava - Shunt ohne MCT-Injektion, entwickelt pulmonalen Hypertonie (mPAP> 25 mmHg) zwischen 10 und 20 Wochen nach der Shunt - Induktion 20. Bei 20 Wochen wird der pulmonale Gefäß Histologie dominiert von medialer Hypertrophie der vorge acinar Arterien und Neo-Muskularisierung der intra-acinar Arteriolen. Obwohl einige haben neointimalen Läsionen auch in diesem Modell 20 beschrieben worden ist , muss die Entwicklung dieser Läsionen t o bestätigt und quantifiziert werden. Das Sugen-Hypoxie-Modell. Ein weiteres gemeinsames Modell für PAH mit Neointima-Läsionen ist die Sugen5416-Hypoxie (SuHx) Ratte. Sugen5416 blockiert den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -Rezeptor. Dies induziert endotheliale Zellschäden und eine Signalkaskade , die in Verbindung mit Hypoxie, endotheliale Apoptose und Proliferation evoziert 22. Nach Sugen5416 Injektion wird die Ratte für 4 Wochen in einem hypoxischen Kammer gegeben, auf die PAH entwickelt. Die Ratte wird dann 4 Wochen Normoxie erneut belichtet. Pharmakologische Verbindungen , die endotheliale Apoptose-Resistenz oder die Signalkaskaden von TGF-B und BMP Ziel haben das Potenzial gezeigt , um die Neointima - Läsionen in diesem Modell 23 umkehren, 24, 25. Eine neue Variante des SuHx Modell ist das Sugen-pneumectomy Modell, das auch mit Neointima-Läsionen bei schweren PAH-Ergebnisse > 26. Allerdings hat dieses Modell nicht vollständig charakterisiert. Eine neuartige genetische Verfahren PH in Ratten zu induzieren , beinhaltet eine Mutation in der BMP-Rezeptor-2 - Gen, das in signifikanten Muskularisierung (PH) ergibt aber keine Neointima - Bildung (PAH) 27. Vergleichbare Ergebnisse wurden in dem Endstadium von unbehandeltem SuHx und MCT + Fluss Ratten 28 hinsichtlich der Anzahl der Läsionen Neointima und der Grad der luminalen Okklusion berichtet. Die Hauptunterschiede zwischen den beiden Modellen sind 1) , daß die mPAP in MCT + Fluss progressiv zunimmt, während in SuHx hat die mPAP allmählich nach erneuter Exposition gegenüber Normoxie zu verringern 28 gezeigt; 2), dass das MCT + Flow-Modell eine frühe Krankheitsstadien kennt, durch mediale Hypertrophie und endotheliale Dysfunktion gekennzeichnet; 3), dass die Zeit es braucht, beide Modelle eine End-Stadium, in dem Rechtsherzversagen beginnt zu erreichen zu entwickeln (4 Wochen in MCT + Flow 8 Wochen SuHx)ef "> 28 unterscheidet, und 4) dass Sugen5416 interferiert in einer molekularen Weg (VEGF) , deren Rolle in der Pathogenese von PAH , ist noch unklar Diese Übersetzung für die menschliche PAH behindern.. Zukünftige Anwendungen oder Wegbeschreibungen Die unterschiedlichen Krankheitsphasen des MCT + Flow-Modell erlauben eine 1) die Mechanismen der Krankheitsprogression (menschliches Gewebe im Allgemeinen zu testen, ist nur von post-mortem oder Explantation Verfahren) und 2) in verschiedenen Strategien zu testen Interventionen. Eine präventive Strategie könnte bei der Konstruktion des Shunts (MF7) eingeleitet werden. Eine frühe Intervention kann bei MF14 eingeleitet werden. Dies kann als eine Behandlungsstrategie vor dem Shunt-Verschluss bei Kindern mit einem angeborenen Herz Shunt und die damit verbundenen PAH relevant sein, die in der Grauzone zwischen reversiblen und irreversiblen Krankheit fortgeschritten ist. Reversal-Strategien können bei MF21 oder MF28 eingeleitet werden. Spätere Stadien zeigen beide neointimalen Läsionen, eine Manifestation im Endstadium PAH. </ P> Abschließend schafft die Zugabe von erhöhten pulmonalen Fluss zu MCT bei Ratten ein Modell der progressive und schweren PAH, die menschliche Krankheitsentwicklung nachahmt. Rechtsherzkatheter und die qualitative und quantitative Beurteilung des Gefäß Histopathologie in diese und andere Modelle für PAH die Eckpfeiler der Krankheit Charakterisierung bilden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shunt Surgery | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9% | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
| Right Heart Catheterization | |||
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10 x 10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10 mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9% | for flushing | ||
| Vascular Morphology | |||
| 50 mL Syringe | |||
| 4% Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| ImageJ | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
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