Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Summary

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Abstract

El carcinoma de células renales (CCR) afecta> 60.000 personas en los Estados Unidos cada año, y ~ 30% de los pacientes con CCR tienen múltiples metástasis en el momento del diagnóstico. CCR metastásico (CCRm) es incurable, con una mediana de supervivencia de sólo 18 meses. Intervenciones basadas inmune (por ejemplo, interferón (IFN) y la interleuquina (IL) -2) inducir respuestas duraderas en una fracción de los pacientes CCRM, y los inhibidores de multicinasas (por ejemplo, sunitinib o sorafenib) o anti-VEGF de los receptores de anticuerpos monoclonales (mAb) son en gran medida paliativa, como remisiones completas son raras. Tales deficiencias en las terapias actuales para pacientes mRCC proporcionan el fundamento para el desarrollo de protocolos de tratamiento novedosas. Un componente clave en el ensayo preclínico de nuevas terapias para CRm es un modelo animal adecuado. características beneficiosas que recapitular la condición humana incluyen un tumor primario renal, metástasis de tumores renales, y un sistema inmunológico intacto para investigar cualquier effecto inmune terapia impulsadarespuestas r y la formación de factores inmunosupresores inducida por tumores. Este informe describe un modelo ortotópico de ratón CCRm que tiene todas estas características. Se describe una técnica de implantación intrarrenal usando la línea celular de adenocarcinoma de ratón renal Renca, seguido por la evaluación del crecimiento del tumor en el riñón (sitio primario) y los pulmones (sitio metastásico).

Introduction

Carcinoma de células renales (RCC) es responsable de la mayoría de los neoplasmas malignos de riñón y aproximadamente el 3% de todos los tumores malignos de adultos en todo el mundo ^{1, 2.} Debido a la falta de los síntomas, diagnóstico erróneo, y herramientas de detección suficientes para RCC, casi el 30% de los pacientes presentará con RCC metastásico (CCRm) en el momento del diagnóstico, con un 20-30% adicional de pacientes que evolucionan hacia una etapa metastásica ^2. Estos casos dan lugar a ~ 13.500 muertes al año ^{1, 3.} Aunque la detección y el tratamiento del CCR primaria anterior ha mejorado, la tasa de muerte relacionada con el RCC sigue aumentando, lo que sugiere que la enfermedad metastásica es en gran parte responsable de la mortalidad ^3. el desarrollo de la terapia para el CCR ha progresado a lo largo de la última década con el descubrimiento y la aplicación de terapias e inmunoterapias dirigidas. Por desgracia, surviv libre de progresiónal y la supervivencia global de los casos avanzados son todavía muy por debajo de 2 años para la mayoría de los pacientes ^{4, 5, 6.} Estas estadísticas justifican la necesidad de seguir investigando en la identificación y desarrollo de tratamientos eficaces para el CCR. Para avanzar de manera adecuada las intervenciones terapéuticas para el cáncer renal metastásico, primero se necesitan modelos preclínicos en traslación-relevantes de la enfermedad.

Desarrollo de un modelo relevante y consistente para recapitular la condición humana de CCR avanzado debe abordar varias preguntas clave: 1) es el modelo anatómico relevante; 2) ¿Tiene el progreso del tumor de manera similar a la patología humana; 3) surgen metástasis del tumor primario; y 4) ¿Puede la progresión del tumor primario y metastásico ser monitoreado en el tiempo? Dependiendo del tipo de tratamiento que está siendo investigado, líneas tumorales RCC ratón de células, líneas celulares tumorales de RCC humanas, y RCC xenog humano derivado del pacientebalsas se pueden usar en ratones inmunocompetentes o inmunodeficientes. Se requiere un huésped con un sistema inmunológico intacto y funcional para aquellos estudios que evalúan algún aspecto de la inmunoterapia, necesitando el uso de la línea de células Renca bien descrito derivada de un adenocarcinoma renal espontáneo de ratones Balb / c ^7. La mayoría de estudios inyectan células Renca por vía subcutánea (sc), que forma un tumor local fácil de medida, o por vía intravenosa (iv) en ratones Balb / c para producir experimentales de pulmón "metástasis" ^{8, 9, 10, 11, 12.} El uso de un tumor Renca sc-implantado para modelar RCC humano tiene una serie de limitaciones, incluyendo la inervación inexacta de la vasculatura ^13, las diferencias en microambiente ^{14, 15,} y una falta de órgano / tumor comunic celularación ^{13, 16.} Además, muchos tumores SC (especialmente Renca) no metastatizan a los órganos distales, inhibiendo el estudio de un evento que es una común clínico característico ^17. Para el estudio de cáncer renal metastásico, células Renca pueden ser inyectados iv para establecer la carga tumoral en los pulmones-la ubicación principal de metástasis en pacientes con CCR. El método de inyección iv de iniciar los tumores metastásicos, sin embargo, no permite la investigación de cómo, cuándo, o por qué las células han emigrado desde el órgano primario (es decir, el riñón) al sitio distante. Un modelo tanto con la enfermedad primaria y metastásica evidente en el mismo animal es crucial para estudiar la progresión y el tratamiento de la enfermedad avanzada, especialmente considerando que las metástasis son típicamente la causa de la mortalidad en estos pacientes.

Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo murino de cáncer renal metastásico que incorpora todas las características señaladas anteriormente. Establecer pr, tumores ortotópicos imary, células Renca se implantan directamente en el riñón del animal a través del peritoneo translúcido. Una pequeña incisión en el flanco izquierdo permite la visualización del bazo (como un punto de referencia) y el riñón izquierdo. Usando una aguja de calibre pequeño, las células tumorales Renca se inyectan directamente en el riñón a través del peritoneo para la implantación ortotópica. En comparación con otros métodos de implantación de células Renca por debajo de la cápsula renal ^18, este método de implantación permite un rendimiento más alto, ya que es bastante no invasivo, no requiere sutura, es de una clase baja dolor, y es eficiente en el tiempo cuando experto.

Este bien caracterizados los resultados del modelo en la carga reproducible primaria tumor (~ 99% de tasa de take) en el riñón inyectado, así como la carga tumoral metastásico en los pulmones. Las ventajas significativas de este modelo incluyen su naturaleza singénicos, lo que permite investigaciones de inmunoterapia; sus metástasis espontáneas, para estudiar unaenfermedad dvanced; y su implantación ortotópica, para modelar el impacto anatómica sobre la progresión de la enfermedad y el tratamiento. Las terapias dirigidas a la orientación RCC se beneficiarían enormemente de la utilización de este modelo durante el desarrollo preclínico.

Protocol

El siguiente protocolo describe un procedimiento experimental para inducir y control del crecimiento de los tumores renales ortotópicos experimentales y cualquier metástasis espontáneas potenciales. Todos los siguientes procedimientos se realizan de conformidad con las políticas institucionales y procedimientos aprobados con respecto al uso humano de los animales de experimentación. 1. Mantenimiento de líneas celulares Mantener la línea celular de adenocarcinoma renal murino, Renca, en Roswell …

Representative Results

La implantación exitosa de células Renca resultará en el desarrollo de tumores en el riñón y la metástasis a los pulmones de los ratones. Después de la escisión del tumor-cojinete y los riñones contralaterales, se midieron los pesos de los tejidos húmedos (G) para demostrar la carga tumoral basado en el aumento de peso (Figura 1). Tumores Renca se pueden identificar mediante técnicas de inmunohistoquímica a través de citoqueratina 8 y 18 tinción <stro…

Discussion

Se presenta un protocolo para un modelo ortotópico de ratón RCC. La implantación de células tumorales de adenocarcinoma renal de ratón en el riñón de ratón proporciona un modelo clínicamente relevante de CRm. Este modelo resulta en un tumor primario en el riñón y la metástasis distante en los pulmones, las cuales son características de RCC avanzado. La descripción presentada en este documento es específico para la línea celular Renca en ratones inmunocompetentes Balb / c. Utilizando este modelo ortotópi…

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947