Electroforese Capilar Separação de Anticorpo Monoclonal isoformas utilizando um capilar de ponto morto

Summary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Abstract

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Introduction

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são proteínas bioterapêuticos com crescente interesse devido à sua capacidade de agir contra várias doenças crónicas e degenerativas ^1. Como outras biomoléculas, os mAbs são propensos a sofrer várias alterações físico-químicos em todas as fases do seu ciclo de vida (ou seja, a partir de biossíntese para o produto final). Tais modificações incluem, mas não estão limitados a: desamidação, glicosilação, oxidação, ciclização, isomerização, a agregação e a clivagem proteolítica ^2. Assim, técnicas analíticas capazes de resolver isoformas intrínsecas são necessários para monitorar mAbs heterogeneidade e estabilidade a fim de estabelecer especificações de qualidade.

A electroforese capilar (CE) é uma tecnologia de separação de alta performance realizada outinside de um tubo de sílica fundida estreita (gama uM) cheio com um electrólito de fundo (BGE). Após a aplicação de um campo eléctrico (até 30.000 V), molécula carregadas migrar para o eletrodo com carga oposta (ie, separação orientada por electro). O uso de altas tensões no CE permite análises rápidas e uma maior eficiência, que são superiores a electroforese em gel clássica. Eletroforese capilar de zona (CZE) é uma técnica baseada CE rotineiramente utilizado na indústria biofarmacêutica para a avaliação da qualidade do produto ^3-9. Ao contrário de outros modos de Ce (por exemplo, electroforese capilar em gel, isoeléctrica capilar de focagem) ou métodos baseados em cromatografia, CZE pode ser realizado sem a utilização de agentes desnaturantes ou interfaces de fase sólida, permitindo a análise da heterogeneidade inerente de mAbs próximo ao seu estado nativo ¹⁰ . CZE separação de isoformas de mAb ocorre dentro de um capilar de sílica fundida coberta com um polímero hidrofílico (capilar neutro) e baseia-se na sua mobilidade electroforética diferente, que é regida por carga, massa, tamanho e forma (ou volume hidrodinâmico) ^11. porções de mAb são detectados quandoeles são mobilizadas e passe através da janela de detecção, que é detectada por um detector de ultravioleta (UV) a absorvância a 214 nm ^{de 4.}

O sucesso da implementação desta técnica analítica dependerá a devida atenção aos detalhes antes e durante o experimento. Agindo de outra forma vai aumentar o custo eo tempo para realizar a análise, levando a falha constante e frustração.

Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo para realizar uma análise bem-sucedida de mAb heterogeneidade por CZE através da explicação detalhada sobre a preparação de soluções e amostras, a preparação do sistema CE, os métodos instrumento criado, a aquisição de dados e o processamento. Para o propósito deste tutorial, um factor alfa de necrose anti-tumoral totalmente humano recombinante (anti-TNF) é o mAb usado como modelo de proteína; no entanto, este protocolo pode ser facilmente customizado para a análise de outras proteínas considerando breves modificações. UMAdditionally, várias recomendações para mitigar possíveis problemas são propostos. O leitor é encorajado a seguir rigorosamente o protocolo proposto, como a probabilidade de sucesso irá aumentar.

Protocol

1. Preparação de Soluções Preparar a solução BGE. Preparação de 100 ml de uma solução composta de 0,05% (m / v) de celulose hidroxi propil metil celulose (HPMC), 200 mM de ε amino-n-capróico ácido (EACA) e acetato de lítio 30 mM. NOTA: Como HPMC é um polímero viscoelástico, despeje o pó para um copo de vidro, adicionar 80 ml de água e, finalmente, adicionar a barra de agitação. Continue a adicionar os restantes reagentes como normalmente. Use óculos de se…

Representative Results

A Figura 2 mostra o perfil de corrente eléctrica típica de um EACA 200 mM, 30 mM de acetato de lítio, pH 4,8 com BGE amostra anti-TNFa mAb diluído com tampão Tris (50 mM, pH 8,0). Como pode ser observado, a corrente é estável durante toda a análise e pode oscilar entre os valores de 30 a 35 uA. A Figura 3 mostra o electroferograma CZE de uma amostra em branco onde o pico detectado corresponde ao padrão interno de histamina. Espera-se para a hist…

Discussion

Neste tutorial, destacamos a importância de práticas adequadas na condução CZE análises de mAbs, a fim de aumentar a probabilidade de sucesso. No entanto, quando CZE é usado de forma rotineira, questões surgem inevitavelmente ^12.

Para melhores resultados, é importante seguir as notas que foram incluídos ao longo do protocolo, como eles vão ajudar o analista a superar e resolver problemas difíceis passos. Uma consideração importante para obter uma melhor resolução a …

Materials

Glacial acetic acid	Tecsiquim	AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid	J.T. Baker	9535-05
Histamine dihydrochloride	Fluka	53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose	Fluka	09963
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	517992
6-Aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System	Beckman Coulter	A66528
eCAP Neutral capillary	Beckman Coulter	477441
Vial, Micro, 200 µl	Beckman Coulter	144709
Universal Vial Caps	Beckman Coulter	A62250
Universal Vials	Beckman Coulter	A62251
Cable, Optics, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
UV/Vis Detector Module	Beckman Coulter	144733
Cartridge Assembly Kit, Blank	Beckman Coulter	144738