Electrophorèse Capillaire séparation de l'anticorps monoclonal isoformes Utilisation d'un Capillaire Neutre

Résumé

Ici, nous présentons un protocole complet d’électrophorèse de la zone capillaire pour l’évaluation de l’hétérogénéité physicochimique intrinsèque des anticorps monoclonaux en tant qu’attribut de qualité.

Résumé

Les protéines biothérapeutiques, telles que les anticorps monoclonaux (mAb), sont des alternatives réalisables pour le traitement des maladies dégénératives chroniques. L’activité biologique de ces protéines dépend de leurs propriétés physico-chimiques. L’utilisation de techniques performantes comme la chromatographie et l’électrophorèse capillaire a été décrite pour l’analyse de l’hétérogénéité physico-chimique des anticorps monoclonaux. De nos jours, la technique de l’électrophorèse de la zone capillaire (CZE) constitue l’un des tests les plus résolutifs et les plus sensibles pour l’analyse des biomolécules. De plus, la séparation électro-entraînée dans CZE est régie par des propriétés étendues de la matière et offre l’avantage d’analyser des protéines proches de leur état natif. Cependant, la mise en œuvre réussie de cette technique pour l’analyse de routine dépend des compétences de l’analyste aux étapes critiques de la préparation de l’échantillon et du système. Le but de ce tutoriel est de détailler les étapes pour réussir l’analyse CZE des mAbs. De plus, ce protocole peut être utilisé pour le développement et l’amélioration des compétences du personnel impliqué dans les laboratoires de chimie analytique des protéines.

Introduction

Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des protéines biothérapeutiques avec un intérêt croissant en raison de leur capacité d'agir contre plusieurs maladies chroniques et dégénératives ^1. Comme d' autres biomolécules, les mAb sont sujettes à subir plusieurs modifications physico - chimiques à tous les stades de leur cycle de vie (ie, de la biosynthèse du produit final). De telles modifications comprennent, mais sans s'y limiter: la désamidation, la glycosylation, l' oxydation, la cyclisation, l' isomérisation, l' agrégation et le clivage protéolytique ^2. Par conséquent, les techniques d'analyse capables de réso....

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer la solution BGE.
   1. Préparer 100 ml d'une solution composée de 0,05% (m / v) de cellulose, l'hydroxy propyl méthyl cellulose (HPMC), 200 mM de ε-amino n-caproïque (EACA) et 30 mM d'acétate de lithium.
      NOTE: Comme HPMC est un polymère viscoélastique, verser la poudre dans un bécher en verre, ajouter 80 ml d'eau et enfin ajouter la barre d'agitation. Continuez à ajouter les autres réactifs comme normalement. Porter des lunettes de sécurité lors de la manipulation d'acétate de lithium car il peut causer une irritation des yeux.
   2. Ajuster la valeur de pH 4,8 ± 0....

Résultats

La figure 2 montre le profil du courant électrique typique d'un EACA 200 mM, 30 mM d' acétate de lithium à pH 4,8 avec l' échantillon BGE anti TNFa Acm dilué avec du tampon Tris (50 mM, pH 8,0). Comme on peut le constater, le courant est stable tout au long de l'analyse et peut osciller entre des valeurs de 30 à 35 uA. La figure 3 montre l'électrophérogramme CZE d'un échantillon vierge où le pic détecté correspond à l'étalon i.......

Discussion

Dans ce tutoriel, nous mettons en évidence l'importance des pratiques appropriées lors de la conduite CZE analyse de mAb afin d'augmenter la probabilité de réussir. Toutefois, lorsque CZE est utilisé sur une base régulière, les questions se posent inévitablement ^12.

Pour de meilleurs résultats, il est important de suivre les notes qui ont été inclus dans l'ensemble du protocole, car elles aideront l'analyste à surmonter et résoudre les étapes difficiles. Une consid.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique glacial	Tecsiquim	AT0035-7
Acide chlorhydrique de qualité ACS	J.T. Baker	9535-05
Dichlorhydrate d’histamine	Fluka	53300
(Hydroxypropyl)méthylcellulose  ;	Fluka	09963
Acétate de lithium	Sigma-Aldrich	517992
Acide 6-aminocaproïque	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50,0 mM,  ; pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Système d’analyse pharmaceutique	Beckman Coulter	A66528
eCAP Neutre capillaire  ;	Beckman Coulter	477441
flacon, micro, 200 & micro ; l	Beckman Coulter	144709
Bouchons universels	Beckman Coulter	A62250
Flacons universels	Beckman Coulter	A62251
Câble, optique, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
Module de détection UV/Vis	Beckman Coulter Beckman Coulter	144733
Kit d’assemblage de cartouche, vierge	Beckman Coulter

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