중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
단일 클론 항체 (단클론 항체는)으로 인해 여러 가지 만성 및 퇴행성 질환 일에 대해 행동하는 능력에 관심을 증가 biotherapeutic 단백질이다. 다른 생체 분자와 마찬가지로, 모노클로 날 항체가 (최종 제품에 생합성에서, 예) 수명주기의 모든 단계에서 여러 가지 물리 화학적 변형을 받아야하는 경향이있다. 이러한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 탈 아미드 화, 글리코 실화, 산화, 폐환 반응, 이성화 반응, 응집 단백질 분해 절단이. 따라서, 극한 이성체를 해결할 수있는 분석 기법은 품질 사양을 설정하기 위해 모노클로 날 항체 얼룩이 안정성을 모니터링 할 필요가있다.
모세관 전기 영동 (CE)는 배경 전해질 (BGE)로 채워진 좁은 용융 실리카 튜브 (μm의 범위)의 outinside 실시 고성능 분리 기술이다. 전계의인가시에, 충전 분자 (30,000 V까지)의는 반대 전하 (즉, 전기 구동 분리)와 전극으로 이동한다. CE에서 높은 전압의 사용은 전통적인 겔 전기 우수한 고속 분석 및 증가 된 효율을 허용한다. 모세관 영역 전기 영동 (CZE)는 통상적으로 제품의 품질 평가 3-9에 대한 생물 약제 산업에 사용되는 CE 기반 기술이다. CE의 다른 모드 (예, 모세관 전기 영동, 모세관 등전점 포커싱) 또는 크로마토 기반의 방법과는 달리, CZE은 그 나라의 상태 (10)에 가까운 모노클 고유의 이질성의 분석을 허용 변성제 고체상 인터페이스를 사용하지 않고 수행 될 수있다 . 단클론 항체 동종의 CZE 분리는 친수성 고분자 (중립 모세관)으로 피복 용융 실리카 모세관 내부의 발생 전하, 질량, 크기 및 형상 (또는 유체 역학적 부피) (11)에 의해 지배되고 서로 다른 전기 영동 이동성을 기반으로한다. 단클론 항체 잔기 때 검출이들은 동원 214 내지 4에서 자외선 (UV) 흡수 검출기에 의해 감지 된 검출 윈도우를 통과한다.
이러한 분석 기술의 성공적인 구현은 전 실험 기간 동안 세부 적절한주의에 달려있다. 궁극적으로 지속적인 실패와 좌절로 이어지는 분석을 수행하기 위해 비용과 시간을 증가시킬 것이다, 그렇지 않으면 연기.
여기서는 용액 및 시료 CE 시스템 설정 악기 방법, 데이터 수집의 제제의 제조에 대한 상세한 설명을 통해 CZE 의해 단클론 이질성 성공적인 분석을 수행하는 단계별로 제시하고, 처리. 이 가이드의 목적을 위해, 재조합 완전 인간 항 종양 괴사 인자 알파 (TNFα 항) 단클론 항체 단백질 모델로서 사용된다; 그러나,이 프로토콜은 쉽게 간단한 수정을 고려하여 다른 단백질의 분석을 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. 에이dditionally 몇 가지 권장 사항은 잠재적 인 문제가 제안 완화합니다. 독자는 엄격하게 증가 할 것이다 성공 확률로, 제안 된 프로토콜을 따르도록 권장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
실시 CZE가 성공 확률을 높이기 위해 모노클로 날 항체 분석 할 때이 튜토리얼에서, 우리는 적절한 방법의 중요성을 강조 표시합니다. CZE가 일상적으로 사용하는 경우에는, 문제가 필연적으로 발생한다 (12).
최상의 결과를 얻으려면, 그들이 극복하고 어려운 단계 문제를 해결하는 분석가 도움이 될 것 같은 프로토콜을 통해 포함 된주의 사항을 따르는 것이 중요합니?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
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