Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

Summary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Abstract

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Introduction

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son proteínas bioterapéuticos con creciente interés debido a su capacidad para actuar contra varias enfermedades crónicas y degenerativas ^1. Al igual que otras biomoléculas, mAbs son propensos a someterse a varias modificaciones fisicoquímicas en todas las etapas de su ciclo de vida (es decir, desde la biosíntesis en el producto final). Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: la desamidación, glicosilación, oxidación, ciclación, isomerización, la agregación y la escisión proteolítica ^2. Por lo tanto, se necesitan técnicas analíticas capaces de resolver isoformas intrínsecas para supervisar mAbs heterogeneidad y la estabilidad con el fin de establecer las especificaciones de calidad.

La electroforesis capilar (CE) es una tecnología de separación de alto rendimiento realizado outinside de un tubo de sílice fundida estrecho (rango de micras) lleno de un electrolito de fondo (BGE). Tras la aplicación de un campo eléctrico (hasta 30,000 V), molécula cargadas migran hacia el electrodo con carga opuesta (es decir, la separación electro-driven). El uso de altas tensiones en CE permite análisis rápidos y aumento de la eficiencia, que son superiores a electroforesis en gel clásico. Electroforesis de zona capilar (CZE) es una técnica basada en la CE se utiliza rutinariamente en la industria biofarmacéutica para la evaluación de la calidad del producto ^3-9. A diferencia de otros modos de CE (por ejemplo, electroforesis en gel capilar, isoeléctrico capilar de enfoque) o métodos basados en la cromatografía, CZE puede llevarse a cabo sin el uso de desnaturalizantes o interfaces en fase sólida, lo que permite el análisis de la heterogeneidad inherente de mAbs cerca de su estado nativo ¹⁰ . Separación CZE de isoformas de mAb se produce en el interior de un capilar de sílice fundida cubierto con un polímero hidrófilo (capilar neutro) y se basa en su movilidad electroforética diferente, que es gobernado por la carga, la masa, el tamaño y la forma (o volumen hidrodinámico) ^11. restos de mAb se detectan cuandose movilizan y pasan a través de la ventana de detección, que es detectado por un detector de ultravioleta (UV) de la absorbancia a 214 nm ^4.

La implementación exitosa de esta técnica analítica dependerá de la debida atención a los detalles antes y durante el experimento. Actuar de otra manera se incrementará el costo y el tiempo para llevar a cabo el análisis, en última instancia conduce a la insuficiencia constante y frustración.

A continuación, presentamos una guía paso a paso para llevar a cabo un análisis exitoso de mAb heterogeneidad mediante CZE través de la explicación detallada de la preparación de soluciones y muestras, la preparación del sistema de la CE, los métodos de instrumentos creados, la adquisición de datos, y el procesamiento. Para el propósito de este tutorial, un factor de necrosis antitumoral recombinante alfa totalmente humano (anti-TNF) mAb se utiliza como modelo de proteína; Sin embargo, este protocolo se puede personalizar fácilmente para el análisis de otras proteínas considerando breves modificaciones. UNdicionalmente, una serie de recomendaciones para mitigar los posibles problemas se proponen. Se invita al lector a seguir estrictamente el protocolo propuesto, como la probabilidad de tener éxito se incrementará.

Protocol

1. Preparación de soluciones Preparar la solución de BGE. Preparar 100 ml de una solución compuesta de 0,05% (m / v) de celulosa hidroxi propil metil celulosa (HPMC), 200 mM ε-amino n-caproico (EACA) y acetato de litio 30 mM. NOTA: Como HPMC es un polímero viscoelástico, verter el polvo en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 80 ml de agua y, finalmente, añadir la barra de agitación. Continúe añadiendo los reactivos restantes como normalmente. Use gafas de segu…

Representative Results

La Figura 2 muestra el perfil de corriente eléctrica típica de un EACA 200 mM, acetato de litio 30 mM, pH 4,8 BGE con muestra de anti-TNFa mAb diluido con tampón de Tris (50 mM, pH 8,0). Como se puede observar, la corriente es estable durante todo el análisis y puede oscilar entre los valores de 30 a 35 mu. Figura 3 muestra el electroferograma CZE de una muestra en blanco en el que el pico detectado se corresponde con el patrón interno de histamina….

Discussion

En este tutorial, destacamos la importancia de las prácticas adecuadas cuando se realizan los análisis de CZE de anticuerpos monoclonales con el fin de aumentar la probabilidad de tener éxito. Sin embargo, cuando se utiliza CZE de forma rutinaria, los problemas surgen inevitablemente ^12.

Para obtener los mejores resultados, es importante seguir las notas que se incluyeron durante todo el protocolo, ya que ayudarán al analista para superar y resolver problemas de pasos difícil…

Materials

Glacial acetic acid	Tecsiquim	AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid	J.T. Baker	9535-05
Histamine dihydrochloride	Fluka	53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose	Fluka	09963
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	517992
6-Aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System	Beckman Coulter	A66528
eCAP Neutral capillary	Beckman Coulter	477441
Vial, Micro, 200 µl	Beckman Coulter	144709
Universal Vial Caps	Beckman Coulter	A62250
Universal Vials	Beckman Coulter	A62251
Cable, Optics, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
UV/Vis Detector Module	Beckman Coulter	144733
Cartridge Assembly Kit, Blank	Beckman Coulter	144738