Övervakning Astrocyten reaktivitet och spridning in Vitro ischemisk-liknande villkor
Summary
Ischemisk stroke är en komplex händelse där det specifika bidraget av astrocyter till hjärnregionen påverkas utsätts för syrebrist glukos (OGD) är svåra att studera. Den här artikeln presenteras en metod för att få isolerade astrocyter och studera deras reaktivitet och spridning OGD villkor.
Abstract
Ischemisk stroke är en komplex hjärnskada orsakad av en tromb eller emboli hindrar blodflödet till delar av hjärnan. Detta leder till berövande av syre och glukos, som orsakar energi fel och neuronala dödsfall. Efter en ischemisk stroke förolämpning, astrocyter blir reaktiva och föröka sig runt skadan webbplats som den utvecklas. Enligt detta scenario är det svårt att studera specifika bidrag av astrocyter till hjärnregionen utsätts för ischemi. Därför införs denna artikel en metod för att studera primära Astrocyten reaktivitet och spridning under en in vitro- modell av en ischemi-liknande miljö, kallas syre glukos deprivation (OGD). Astrocyter isolerades från 1-4 dag-gammal neonatala råttor och antalet icke-specifik astrocytic celler bedömdes med hjälp av Astrocyten selektiv markör Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) och nukleär färgning. Perioden som astrocyter underkastas villkoret OGD kan anpassas, liksom andelen syre som de utsätts för. Denna flexibilitet gör det möjligt för forskare att karakterisera varaktigheten av villkoret ischemisk-liknande i olika grupper av celler in vitro. I artikeln beskrivs de tidsramar för OGD som inducerar Astrocyten reaktivitet, hypertrofisk morfologi och spridning mätt med immunofluorescens använder frodas Cell nukleära Antigen (PCNA). Förutom spridning, astrocyter genomgå energi och oxidativ stress, och svara på OGD genom att släppa lösliga faktorer till cell medium. Detta medium kan samlas och används för att analysera effekterna av molekyler som släpptes av astrocyter i primära neuronala kulturer utan interaktion från cell till cell. I sammanfattning, kan här primär cell kultur modell användas effektivt att förstå rollen av isolerade astrocyter vid skada.
Introduction
Stroke definieras som ”en akut neurologisk dysfunktion av vaskulärt ursprung med antingen plötslig eller snabb utveckling av symtom och tecken, motsvarande medverkan av målområdena i hjärnan”1,2. Det finns två typer av stroke: ischemisk och hemorragisk. När vaskulär dysfunktion orsakas antingen av ett aneurysm eller en arteriovenös fel, tillsammans med försvagning med bakre bristning av en artär, kallas detta hemorragisk stroke3 , som i de flesta fall leder till döden. När en tromb eller emboli hindrar blodflödet, kallas orsakar ett tillfälligt frihetsberövande av syre och glukos till en hjärnregionen, det ischemisk stroke4. Underlåtenhet att ge näring till cellerna runt det drabbade området eller ischemisk core leder till en homeostatiska och metabolisk obalans, energisk dysfunktion, neuronala dödsfall och inflammation5, som kan framkalla en livslång invaliditet för patienter6.
Ischemisk stroke är en multifaktoriell skada som involverar flera typer av celler som reagerar och utöva deras effekter vid olika tidpunkter. Många interaktioner skapar en svår miljö att studera beteendet hos enskilda celler. Så, hur studerar vi bidrag till en viss celltyp under en så komplex miljö? En accepterad i vitro modell av ischemi består av utsätta celler till syre och glukos deprivation (OGD), under en viss period, följt av återställandet av celler till en normoxic miljö. Detta system simulerar en ischemisk stroke följt av blod reperfusion. I denna metod, är celler eller vävnader utsatta för en glukos-fria medier i en miljö som rensas på syre, med hjälp av en specialiserad hypoxisk kammare. OGD inkubationstiden kan variera från några minuter upp till 24 h, beroende på hypotesen att vill testas. Studier har visat att beroende på tiderna av OGD och normoxic miljö, specifika fenotyper av stroke (dvsakut eller Subkronisk) kan uppnås. Primära isolerade astrocyter, utsätts för OGD med bakre återställande till normoxic förhållanden, är en väl studerat cellulära modell att efterlikna stroke in vitro-7. Använda OGD är möjligt att avslöja oberoende molekylära mekanismer för isolerade celler under en stroke-liknande miljö.
Som vår kunskap om Astrocyten biologi ökar, har det blivit uppenbart att de är avgörande för att upprätthålla synapser och upprätthålla neurala reparation, utveckling och plasticitet8. Under normala förhållanden, astrocyter släppa och svara på cytokiner, chemokiner, tillväxtfaktorer och gliotransmitters, att hålla metabolisk balans och homeostas inom synapser5,9. I akut neuroinflammation, såsom ischemisk stroke, kan dessa celler bli reaktiv, Visa en långsiktig överuttryck av Glial Fibrillary sura Protein (Fredsgenomförande) och Visa hypertrofi i deras morfologi5,10, 11 , 12. eftersom det ischemisk infarct framkallar, homeostas som tillhandahålls av astrocyter blir påverkat, angående normal glutamat upptag, Energiomsättning, utbyte av aktiva molekyler och antioxidant aktivitet13.
Återaktiverade astrocyter föröka runt infarct vävnaden medan leukocyter migrera mot den bort område14. Astrocytic spridning kan mätas med hjälp av markörer såsom prolifererande celler nukleär antigen (PCNA), Ki67 och Bromdeoxiuridin (BrdU)15. Detta proliferativ svar genereras i en tidsberoende sätt och det hjälper bildar gliaceller ärret, en rad irreversibelt reaktiva astrocyter längs parenkymet av skadade platsen efter en skada9. En av de ursprungliga funktionerna i detta ärr är att begränsa de immunceller extravaseringen från detta område. Studier har dock visat att ärret blir ett fysiskt hinder för axoner förlänga, som de släppa molekyler att hämma axonal tillväxt, och skapa en fysisk barriär som hindrar axoner utökar runt det skadade område16. Dock finns det vetenskapliga bevis visar att helt förhindra gliaceller ärrbildning efter en ryggmärgsskada, kan försämra regenerering av axoner17. Således det sammanhang där den specifika astrocytic Svaren mäts, måste beaktas vid ramen för den skada som studerade.
Den presenterade metoden kan användas för att studera funktionen individualiserad av astrocyter efter syre glukos deprivation och det kan ändras beroende på de frågor som utredaren vill besvara. Till exempel förutom morfologisk förändring och de markörer som uttryckts vid olika OGD gånger, supernatanterna från astrocyter utsätts för OGD kan ytterligare analyseras för att identifiera lösliga faktorer släpptes av dessa celler, eller används som en betingad media för att bedöma dess effekt i andra hjärnceller. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier på Astrocyten reaktivitet som kan leda till förtydligandet av de faktorer som styr och modulera deras svar i ett scenario för ischemisk stroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver isolering av astrocyter från råtta cortices. Den här metoden är det viktigt att minska kontaminering med andra cellulära typer såsom mikroglia, oligodendrocyter och fibroblaster. För att minska antalet mikroglia, flera åtgärder kan vidtas: ändra media, orbital skakar och kemiska behandlingar. När kulturen renhet har bekräftats genom immunofluorescens med selektiv cellulära märkpennor eller för de mest framstående cell föroreningarna kan experiment utföras. Antikropp mot Jo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Paola López Pieraldi för tekniskt bistånd. Berits är tacksamma för bidrag 8G12MD007600 och U54-NS083924 som stöds denna publikation. Vi tackar NIH-NIMHD-G12-MD007583 stipendium för anläggningen stödja. D.E.R.A. är tacksam för den gemenskap som tillhandahålls av NIHNIGMS-R25GM110513. Vi är tacksamma för användning av det gemensamma Instrumentation-området och hjälp av Dr Priscila Sanabria för användning av optisk Imaging anläggningen av RCMI program av bevilja G12MD007583. Dessutom vill vi tacka Jose Padilla för hans enastående roll i filma och redigera visual protokollet.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neurosciences. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
